Generation av en gen-stört Streptococcus mutans stam utan genen kloning

Summary

Vi beskriver en lättköpt, snabba och relativt billig metod för generering av gen-stört Streptococcus mutans stammar; Denna teknik kan anpassas för generering av gen-stört stammar av olika arter.

Abstract

Typiska metoder för förtydligandet av funktionen av en särskild gen innebär jämförande fenotypiska analyser av vildtyps-stammen och en stam där genen av intresse har störts. En gen-störningar DNA konstruktion som innehåller en lämplig markör antibiotikaresistensgen är användbart för generering av gen-stört stammar i bakterier. Dock innebära konventionella byggmetoder, som kräver gen kloning steg, komplexa och tidskrävande protokoll. Här beskrivs en relativt lättköpt, snabb och kostnadseffektiv metod för riktade gene störningar i Streptococcus mutans . Metoden utnyttjar en 2-stegs fusion polymeras-kedjereaktion (PCR) för att generera störningar konstruera och elektroporation för genetisk transformation. Denna metod kräver inte en enzymatisk reaktion, än PCR, och erbjuder dessutom större flexibilitet när det gäller utformningen av den störningar konstruktion. Anställning av elektroporation underlättar utarbetandet av behöriga celler och förbättrar omvandling effektiviteten. Denna metod kan anpassas för generering av gen-stört stammar av olika arter.

Introduction

Gen funktion analys innebär vanligtvis en fenotypisk jämförelse mellan en vildtyp stam och en stam där en särskild gen av intresse har störts. Denna gen-störningar teknik har använts för gen funktion analyser i ett brett utbud av taxa, från bakterier till däggdjur. En gen-störningar konstruktion krävs för generering av den gen-stört stammen; Denna deoxiribonukleinsyra (DNA) konstruktion består av den markörgen för antibiotikaresistens som smält till uppströms och nedströms angränsande regioner av målgenen och införlivas i genomet via homolog rekombination. Gen-stört stammen kan isoleras med selektiva medier som innehåller antibiotika. Den konventionella metoden som används för konstruktion av gen-stört stammen kräver komplexa steg, till exempel förstärkning av målgenen av polymeraskedjereaktion (PCR), ligatur av genen in i en lämplig plasmid, matsmältningen med begränsning enzymer och religation att infoga antibiotika-resistens markörgen. Denna process är tidskrävande, tar flera dagar till flera veckor, beroende på framgången för varje steg. Utformningen av störningar konstruktioner är dessutom beroende av restriktionsenzym webbplatser av målgenen. Lös dessa problem genom har PCR-baserade DNA skarvning metoder^1,2 för design av gen-stört mutanter av Dictyostelium discoideum³ och Synechocystis sp. PCC6803⁴ rapporterats. I den aktuella studien utvecklades en metod för att generera en gen-stört streptokocker stam i en relativt snabb, lättköpt och billigt sätt, använda en modifierad PCR-baserade metod (designerat 2-steg fusion PCR) för byggande av störningar konstruera och elektroporation för genetisk transformation.

2-stegs fusion PCR kräver genomiskt DNA, markörgen för antibiotikaresistens som PCR-mall och fyra par lämpligt utformad oligonukleotiden primers. I det första steget (1^st PCR), en 1-kb uppströms flankera region av målgenen, en 1-kb nedströms flankera region i målet förökas, och genen de antibiotika-resistens markör med PCR. 5′ regionerna både reverse primer och den framtida primern, för förstärkning av uppströms och nedströms inkluderar angränsande regioner, respektive 15 baser komplement till ändarna av genen markör. 5′ regionerna av både framåt och bakåt primers för markör gen förstärkning på samma sätt inkluderar 15 baser kompletterar den nedre änden av målgenen uppströms flankera regionen och den övre änden av målgenen, nedströms flankera regionen respektive. Därför innehålla tre förstärkta fragment överlappande 30-baspar regioner på webbplatsen fusion. I det andra steget (2^nd PCR) utförs PCR med nästlade PCR primers använder tre fragmenten förstärks av 1^st PCR som mallar. De kompletterande regionerna av mallarna är dessutom kopplade till varandra via 2^nd PCR. Slutligen introduceras konstruktionen för homolog rekombination till vildtyp stam av elektroporation. Framgångsrik gen störningar kan verifieras genom PCR använder specifika primers. Även om den störningar konstruktionen är förstärkt med HiFi-DNA-polymeras, behövs inte ytterligare enzymatiska reaktioner, såsom DNA-ligering eller DNA matsmältningen, att generera konstruktionen. Dessutom kan en borttagna eller konserverade region på genomet väljas flexibelt enligt primer design.

I den nuvarande arbetet utfördes radering av hela kodande regionen av gtfC -genen, som kodar glukosyltransferas i Streptococcus mutans, för att demonstrera metoden snabb, enkel gen störningar i släktet streptokocker. Dessutom en gtfB-störd stam genererades på samma sätt. De glucosyltransferases som kodas av både gtfC och gtfB bidra till cariogenic dental biofilm utveckling^5,6. Biofilm-bilda kapaciteterna av vildtyp stam (S. mutans WT), gtfC-stört stam (S. mutans ΔgtfC) och gtfB-störd stam (S. mutans ΔgtfB) utvärderades för jämförande fenotypiska analyser. Detta protokoll utsträcks tillämpningen av en två-stegs metod för genen avbrott en ytterligare arter och kan ändras för studier av geners funktion i ett bredare utbud av taxa.

Protocol

1. primer Design förbereda primers för 2-stegs fusion PCR och verifiering av genen störningar. Obs: Tabell 1 visar de primer sekvenser används i detta protokoll. figur 1 visar en Schematisk illustration av 2-stegs fusion PCR-metoden används för att generera S. mutans Δ gtfC. Design primers för ersättning av målregionen i genomet med Spektinomycin-motstånd genen (spc r) <sup class="x…

Representative Results

Figur 2 visar att storleken på varje produkt från 1st PCR, som observerats på 1% agarosgel, var bra överens med den förväntade storleken av ungefär 1 kb. Figur 3 visar gelelektrofores analysen av produkterna av 2nd PCR. Figur 4 visar S. mutans kolonier omvandlas med den störning konstruktionen och en gelelektrofores analys av kolonin PCR-produkter. Amplikoner fr…

Discussion

I detta protokoll, måste primers för 1^st PCR utformas för att förstärka ungefär 1 kb uppströms och nedströms angränsande regioner i målregionen i genomet. Sådana länge flankera sekvenser är nödvändigt att förbättra effektiviteten i homolog rekombination.

Sekvenserna av primers (uppåt-bakåt, nedåt-framåt, spc^r-framåt, och spc^r-omvänd) i detta protokoll var bestäms automatiskt baserat på platsen för införlivandet av de…

Materials

Streptococus mutans	Stock strain in the lab.		Wild-type strain (Strain UA159)
Genomic DNA extraction kit	Zymo Research	D6005
Bead-beating disruption apparatus	Taitec	GM-01
Synthetic genes	Eurofins Genomics	Custom-ordered	Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene
Thermal cycler	Astec	PC-708
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered	35 bases in length
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Spectrophotometer	Beckman Coulter	DU 800
Electroporator	Bio-rad	1652100
Electroporation cuvette	Bio-rad	1652086	0.2-cm gap
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture media
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics
Erythromycin	Wako	057-07151	Antibiotics
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining