منصة ملاقط مغناطيسية جزيء واحد للتعامل مع كوادروبليكسيس ز هو عنها، مما يسمح لدراسة الاستقرار G4 وتنظيم البروتينات المختلفة.
بنية الحمض النووي المتعارف عليه عدم الثانوية ز-قوادروبليكسيس (G4) تشارك في العمليات الخلوية المتنوعة، مثل تكرار الحمض النووي، والنسخ، وتجهيز الجيش الملكي النيبالي، واستطالة telomere. خلال هذه العمليات، وربط مختلف البروتينات وحل هياكل G4 أداء وظيفتها. وظيفة G4 غالباً ما يعتمد على استقرار هيكلها مطوية، من المهم أن التحقيق في كيفية تنظيم G4 ملزم البروتينات استقرار G4. ويعرض هذا العمل وسيلة التعامل مع جزيئات G4 واحد استخدام الملقط المغناطيسي، الذي يتيح للدراسات المتعلقة بتنظيم G4 ملزم البروتينات في جزيء G4 واحد في الوقت الحقيقي. بشكل عام، هذا الأسلوب مناسبة لنطاق واسع من التطبيقات في الدراسات لتفاعلات البروتينات/يغاندس والأنظمة المتعلقة بمختلف الهياكل الثانوية الحمض النووي الريبي أو.
الذين تقطعت بهم السبل-أربعة هياكل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي G4 أدواراً حاسمة في العديد من العمليات البيولوجية المهمة1. تشارك العديد من البروتينات في ملزمة G4 والتنظيم، بما في ذلك telomere ملزم البروتينات (تيلوميراسي، POT1، تيببس TRF2، الجيش الوطني الرواندي)1،2، عوامل النسخ (نوكليولين، PARP1)3من الحمض النووي الريبي معالجة البروتينات (hnRNP A1، hnRNP A2)4,5من هيليكاسيس (بلم، فانكج، وراو، تحذير، Dna2، Pif1)، وتكرار الحمض النووي المتعلقة بالبروتينات (بريمبوليميراسي Rif1، REV1،)6. يمكن تثبيت ملزمة البروتين أو زعزعة استقرار هياكل G4؛ وهكذا تنظم الوظائف البيولوجية اللاحقة. وكان يقاس استقرار G4 الحراري ذوبان باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أو طرق دائرية تلوانيه (CD)7. غير أن هذه الشروط لا الفسيولوجية ذات الصلة، ومن الصعب أن تطبق على دراسة آثار ملزمة بروتينات7.
وقد مكن التطور السريع في تقنيات التلاعب جزيء واحد الدراسات قابلة للطي والتي تتكشف من بيوموليكولي، مثل الحمض النووي أو بروتين، على مستوى جزيء واحد مع القرار نانومتر في الوقت الحقيقي8. مجهر القوة الذرية (AFM)، وملاقط بصرية، وملاقط مغناطيسية هي أساليب التلاعب جزيء واحد الأكثر استخداماً. بالمقارنة مع فؤاد وملاقط بصرية9، تسمح ملاقط مغناطيسية قياسات مستقرة للديناميات التي تتكشف للطي لجزيء واحد على مر الأيام باستخدام10،تقنية لمكافحة انجراف11.
هنا، هو منبر تلاعب جزيء واحد استخدام الملقط المغناطيسي لدراسة تنظيم الاستقرار G4 ملزمة بروتينات عنها12،13. ويوجز هذا العمل النهج الأساسية، بما في ذلك عينة وتدفق إعداد القناة وإعداد ملاقط مغناطيسية، ومعايرة القوة. تسمح سيطرة القوة وبروتوكولات مكافحة الانجراف كما هو موضح في الخطوة 3 لمقاييس الزمن منذ فترة طويلة تحت مختلف عناصر القوة، مثل قوة ثابتة (قوة المشبك) وتحميل ثابت معدل (القوة-منحدر)، وقياس قوة القفز. يتيح البروتوكول معايرة القوة هو موضح في الخطوة 4 معايرة القوة < 1 ميكرومتر الحبال القصيرة على مدى قوة واسعة النطاق pN يصل إلى 100، مع خطأ نسبي في حدود 10%. مثال على التنظيم لاستقرار هيليكاز الحمض النووي الريبي المرتبطة بالاتحاد الأفريقي-الغنية بعنصر (راو) هيليكاز (الملقب DHX36، G4R1) التي تضطلع بأدوار أساسية في حل يستخدم G4 الحمض النووي الريبي لإظهار تطبيقات هذا البرنامج13.
كما هو موضح أعلاه، منبرا لدراسة استقرار الحمض النووي G4 الميكانيكية وتفاعلات البروتين باستخدام G4 يقال ملاقط مغناطيسية جزيء واحد. المصاحبة للمنهاج، هي وضع بروتوكولات ذات كفاءة عالية للعثور على حبل G4 الحمض النووي، وقياس الديناميات التي تتكشف للطي واستقرار الهيكل G4 مع القرار الخاص نانومتر. …
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون عموم منغ لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط. ويدعم هذا العمل “سنغافورة وزارة للتعليم الأكاديمي البحث صندوق الطبقة” 3 (MOE2012-T3-1-001) إلى ج. ي؛ المؤسسة الوطنية للبحوث عن طريق معهد ميتشانوبيولوجي سنغافورة إلى ج. ي؛ المؤسسة الوطنية للبحوث، مكتب رئيس الوزراء، سنغافورة، ضمن “برنامجها إينفيستيجاتورشيب جبهة الخلاص الوطني” (جبهة الخلاص الوطني رقم إينفيستيجاتورشيب جائزة جبهة الخلاص الوطني-NRFI2016-03 إلى ج. ي؛ صندوق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2017KFYXJJ153) إلى ص حاء.
DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |