जी-quadruplexes में हेरफेर करने के लिए एक एकल अणु चुंबकीय चिमटी मंच की रिपोर्ट है, जो विभिन्न प्रोटीन द्वारा G4 स्थिरता और विनियमन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।
गैर विहित न्यूक्लिक अम्ल माध्यमिक संरचना जी quadruplexes (G4) विविध सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल हैं, जैसे डीएनए प्रतिकृति, प्रतिलेखन, आरएनए प्रसंस्करण, और telomere बढ़ाव. इन प्रक्रियाओं के दौरान, विभिंन प्रोटीन बांध और G4 संरचनाओं को हल करने के लिए अपने कार्य प्रदर्शन । के रूप में g4 के समारोह अक्सर अपनी तह संरचना की स्थिरता पर निर्भर करता है, यह जांच महत्वपूर्ण है कि कैसे g4 बाध्यकारी प्रोटीन g4 की स्थिरता को विनियमित । यह काम एक विधि के लिए एक-g4 अणु चुंबकीय चिमटी, जो वास्तविक समय में एक एकल g4 अणु पर g4 बाध्यकारी प्रोटीन के विनियमन के अध्ययन में सक्षम बनाता है का उपयोग कर में हेरफेर करने के लिए प्रस्तुत करता है । सामांय में, यह विधि प्रोटीन/लाइगैंडों बातचीत और विभिंन डीएनए या आरएनए माध्यमिक संरचनाओं पर नियमों के लिए अध्ययन में आवेदनों की एक विस्तृत गुंजाइश के लिए उपयुक्त है ।
चार-असहाय डीएनए या आरएनए G4 संरचनाएं कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1. कई प्रोटीन G4 बाइंडिंग और नियमन में शामिल हैं, जिनमें telomere बाइंडिंग प्रोटीन (टेलोमिरेज, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, प्रतिलेखन कारक (nucleolin, PARP1)3, आरएनए प्रोसेसिंग प्रोटीन (hnRNP A1, hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, २१औ, WRN, Dna2, Pif1)5, और डीएनए प्रतिकृति संबंधित प्रोटीन (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. प्रोटीन बाध्यकारी G4 संरचनाओं को स्थिर या अस्थिर कर सकते हैं; इस प्रकार बाद में जैविक कार्यों को विनियमित । G4 की स्थिरता थर्मल पिघलने से पराबैंगनी (यूवी) या परिपत्र dichroism (सीडी) तरीकों7का उपयोग करके मापा गया था । हालांकि, ऐसी स्थितियों शारीरिक और प्रासंगिक नहीं है बाध्यकारी प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू करने के लिए मुश्किल है7।
एकल अणु हेरफेर प्रौद्योगिकियों में तेजी से विकास की तह और एक डीएनए या एक प्रोटीन के रूप में एक परमाणु, के खुलासा के अध्ययन सक्षम है, एक एकल-नैनोमीटर संकल्प के साथ एक अणु स्तर पर वास्तविक समय में8। परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM), ऑप्टिकल चिमटी, और चुंबकीय चिमटी सबसे अधिक इस्तेमाल किया एकल अणु हेरफेर तरीके हैं । AFM और ऑप्टिकल चिमटी9की तुलना में, चुंबकीय चिमटी एक विरोधी बहाव तकनीक10,11का उपयोग करके दिनों में एक ही अणु की तह-खुलासा गतिशीलता के स्थिर माप की अनुमति देते हैं ।
यहाँ, एक एकल अणु हेरफेर मंच चुंबकीय चिमटी का उपयोग करने के लिए बंधन प्रोटीन द्वारा G4 स्थिरता के विनियमन का अध्ययन12,13सूचना दी है । इस काम के बुनियादी दृष्टिकोण, नमूना और प्रवाह चैनल तैयारी, चुंबकीय चिमटी के सेटअप, और बल अंशांकन सहित रूपरेखा । बल नियंत्रण और विरोधी बहाव प्रोटोकॉल चरण 3 में वर्णित के रूप में विभिन्न बल नियंत्रण, जैसे निरंतर बल (बल दबाना) और निरंतर लोडिंग दर (बल-रैंप), और बल-कूद माप के तहत लंबे समय तक माप के लिए अनुमति देते हैं । बल अंशांकन प्रोटोकॉल चरण 4 में वर्णित सक्षम करता है के लिए बल अंशांकन & #60; 1 µm एक व्यापक बल पर लघु tethers अप करने के लिए सीमा १०० pN, 10% के भीतर एक रिश्तेदार त्रुटि के साथ. आरएनए-Helicase का समाधान करने में आवश्यक भूमिका निभाने वाले AU-अमीर तत्व (२१औ) Helicase (उपनाम DHX36, G4R1) के साथ जुड़े हुए शाहीन की स्थिरता के विनियमन का एक उदाहरण इस मंच के13आवेदनों के प्रदर्शन के लिए प्रयोग किया जाता है ।
1. एकल अणु खींचने के लिए G4 DNA की तैयारी तैयार 5 & #39;-thiol लेबल और 5 & #39;-बायोटिन लेबल dsDNA पीसीआर द्वारा हैंडल DDNA पोलीमरेज़ पर एक लैंब्डा फेज डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करके 5 & #39;-thiol और 5 & #39;-बायोटिन प्राइमर < सुप क्लास = …
जैसा कि ऊपर वर्णित है, g4 डीएनए की यांत्रिक स्थिरता और एक अणु चुंबकीय चिमटी का उपयोग कर g4 के लिए प्रोटीन की बातचीत के अध्ययन के लिए एक मंच की सूचना है । मंच के साथ, g4 डीएनए तार खोजने के अत्यधिक कुशल प्रोटोकॉल…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने पांडुलिपि को ठीक करने के लिए मेंग पैन का शुक्रिया अदा किया । यह काम सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय के अकादमिक अनुसंधान कोष टीयर 3 (MOE2012-T3-1-001) से J.Y. के लिए समर्थित है; Mechanobiology संस्थान सिंगापुर के माध्यम से नेशनल रिसर्च फाउंडेशन को J.Y.; नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, प्रधानमंत्री कार्यालय, सिंगापुर, इसके एनआरएफ Investigatorship कार्यक्रम के तहत (एनआरएफ Investigatorship अवार्ड सं. एनआरएफ-NRFI2016-03 to J.Y.; केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (2017KFYXJJ153) को एच. वाय.
DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |