דנדרימר מבוססי Nanopatterns לא אחיד כדי מקומית משטח שליטה Adhesiveness: שיטה ישירה בידול Chondrogenic
Summary
שיטה להשיג nanopatterns לא אחידה מבוססי דנדרימר כי היתר שליטה ננו של מקומיים ארגינין-גליצין-אספרטית חומצה (RGD) משטח צפיפות תיאר, הוחל על המחקר של תאית התמיינות אדהזיה ו- chondrogenic.
Abstract
אדהזיה הסלולר ובידול הוא נעשים על ידי חיסול הננומטרי הרכיבים מטריצה חוץ-תאית (ECM), עם ריכוזים המקומי יש השפעה גדולה. כאן אנו מציגים שיטה להשיג בקנה מידה גדול nanopatterns לא אחידה של ארגינין-גליצין-אספרטית (RGD)-dendrimers functionalized, כי היתר שליטה ננו של RGD מקומיים על פני השטח צפיפות. Nanopatterns נוצרות על ידי משטח ספיחה של dendrimers של פתרונות בריכוזים שונים ראשונית מאופיינים זווית מגע מים (CA), photoelectron הספקטרומטריה (XPS), ועל סריקת בדיקה מיקרוסקופיית טכניקות כגון מיקרוסקופ מינהור סריקה מנהור, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). הצפיפות השטח המקומי של RGD נמדד באמצעות AFM תמונות באמצעות הסתברות ומפות מתאר של מרחקים interparticle מינימלי, ואז בקורלציה עם התגובה אדהזיה תא ובידול. השיטה nanopatterning המובאת כאן היא הליך פשוט וניתן לשנותם ובצורה ישירה על פני אזורים נרחבים. הוא ולכן הוא תואם באופן מלא עם תא תרבות פרוטוקולים, ניתן להחיל על אחרים ליגנדים זה להפעיל תלויי-ריכוז השפעות על תאים.
Introduction
כאן נתאר פרוצדורה פשוטה ופסיביות מבוססי דנדרימר nanopatterning להשיג משטחים התרבות תאים המאפשרים השליטה של adhesiveness המקומי ב הננומטרי… דווחו הננומטרי פרטים של ארגון ה-ECM,2,1,3 ואת nanopatterning של התא אדהזיה משטחים סיפקה תובנות הדרישות הסלולר הקשורים הידבקות4, 5. ניסויים באמצעות micellar nanopatterns מבוססי ליתוגרפיה חשף ערך סף של 70 nm עבור RGD פפטיד nanospacing, אדהזיה תא שעיכבו באופן משמעותי מעל זה ערך6,7,8 ,9. מחקרים אלה מודגש גם השפעה גדולה של מקומיים יותר. צפיפות ליגנד הכללית תא אדהזיה9,10,11.
במהלך מורפוגנזה, תא אינטראקציות עם הסביבה לעורר את האירועים בידול הראשון, אשר ממשיכים עד נוצר סופית רקמה מורכבת מבני. במסגרת זו, משטחים nanopatterned שימשו כדי להתמודד עם השפעת הגומלין תא-פני הראשונית על מורפוגנזה. מבוסס-ליתוגרפיה nanopatterns RGD עם ריווח לרוחב של 68 nm בβ-סוג Ti-40Nb סגסוגות עזרה לשמור על פנוטיפ מובחן של תאי גזע שאינו מחויב12, בעוד nanospacings RGD של בין 95 ו 150 nm לשפר את הבידול של גזע mesenchymal (MSCs) כלפי adipogenic/osteogenic13,14,15 ו- chondrogenic הגורל16. גם מקרומולקולות וההספק עצמית ששינה עם איתות רכיבים הוכחו ישיר אדהזיה תא ובידול על-ידי מתן ויסות ה-רמזים איתות17אדריכלי ננו. בהקשר זה, נעשה שימוש בתצהיר של dendrimers עם אינטראקציה תא moieties שלהם בתחום החיצוני18,19,20 על משטחי ללמוד תא אדהזיה21,22, מורפולוגיה23,24, הגירה אירועים25,26. עם זאת, חוסר אפיון משטח במחקרים אלה מקשה להקים שום קורלציה בין תצורת משטח דנדרימר ותגובת התא.
ניתן להשיג דנדרימר nanopatterns עם נוזל דמוי סדר ומרווח מוגדר כאשר dendrimers לספוח משטחים טעון-נמוך מפתרונות עם עוצמות יוניים נמוך. 27 על בסיס מאפיין זה, כאן אנו מציגים שיטה להשיג בקנה מידה גדול nanopatterns לא אחידה של RGD-functionalized dendrimers על משטחים נמוכה טעונה היתר שליטה ננו של צפיפות המשטח RGD מקומיים. זווית מגע של מים (CA), photoelectron הספקטרומטריה (XPS), סריקת בדיקה מיקרוסקופיית טכניקות (nanopatterns ה-STM, AFM) הצג כי צפיפות ליגנד מקומי יכול להיות מותאם שינוי הריכוז ההתחלתי דנדרימר בפתרון. צפיפות המשטח RGD המקומי לכמת AFM תמונות מאת ההסתברות ומפות מתאר של מרחקים interparticle מינימלי, ואז בקורלציה עם ניסויים התא. לעומת שיטות אחרות nanopatterning4, nanopatterning מבוססי דנדרימר פשוטה, ניתן בקלות לשנות פני שטחים גדולים, ובכך להיות תואם באופן מלא עם יישומים התרבות תאים. Nanopatterns משמשים בשם דיאלקטריים ביו כדי להעריך את השפעת הצפיפות השטח המקומי RGD תא אדהזיה28 וממשיך את אינדוקציה chondrogenic של MSCs אדם מבוגר29. התוצאות שלנו מראים כי RGD מבוססי דנדרימר nanopatterns לקיים את צמיחת תאים כי התא אדהזיה זה מתחזק גבוהה מקומיים RGD צפיפות המשטח. בניסויים בידול, adhesiveness ביניים של תאים סובסטרטים העדיף MSC עיבוי ובידול chondrogenic המוקדמות. בשל הקלות עם דנדרימר אשר ניתן לשנות קבוצות היקפיים, השיטה המתוארת כאן ניתן להרחיב הלאה כדי אחר ליגנדים ECM זה להפעיל תלויי-ריכוז השפעות על תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך הפיתוח של הפרוטוקול המתואר, יש לשקול מספר צעדים קריטיים. הראשון מתייחס nanopattern אפיון בסריקת טכניקות בדיקה במיקרוסקופ. כדי להמחיש את nanopatterns, השטח שבו מופק המתבנת חייב להיות ערך חספוס מתחת הקוטר אכזרי של dendrimers, אשר הוא סביב 4-5 nm כפי שנמדד על-ידי ה-STM (איור 1B). כמו כן, זה צריך לקחת בח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים מן גופן-באך ו אלברט ג’י Castaño על עזרתם ביישוב dדקות כמת. הם גם מכירים יחידת מתקדמות מיקרוסקופ דיגיטלי במכון לחקר וההתערבות (ברצלונה IRB) לתת המחברים להקליט הוידאו המקומית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי רשת ביו מחקר מרכז (CIBER), ספרד. CIBER הוא שיוזמה ממומן על ידי את השישי הלאומית R & D & אני תוכנית 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider התוכנית, CIBER פעולות, דה אינסטיטוטו סאלוד קרלוס השלישי, עם התמיכה של הקרן לפיתוח אזורי אירופה. עבודה זו היא נתמכה על ידי הנציבות אוניברסיטאות ומחקר של המחלקה של חדשנות, אוניברסיטאות, ארגוני של Generalitat דה קטלוניה (2014 SGR 1442). זה היה גם במימון הפרויקטים OLIGOCODES (מס ‘ MAT2012-38573-C02) ו- CTQ2013-41339-P, מוענק על ידי משרד הכלכלה הספרדית תחרותיות, בנוסף INTERREG V-A ספרד-פורטוגל 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. מודה תמיכה כספית מ ספרדי משרד הכלכלה ואת התחרותיות המענק (מס ‘ IFI15/00151).
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
