Dendrimer-baserede ujævn Nanopatterns til lokalt kontrol flade Adhesiveness: en metode til direkte Chondrogenic differentiering
Summary
En metode til at opnå dendrimer-baserede ujævn nanopatterns, der tillader nanoskala kontrol af lokale arginin-glycin-aspartinsyre-syre (M.H.T.) overflade tæthed er beskrevet og anvendes til undersøgelse af adhæsion og chondrogenic Celledifferentiering.
Abstract
Cellulære vedhæftning og differentiering er betinget af nanoskala disponeringen af ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, med lokale koncentrationer med en større virkning. Her præsenterer vi en metode til at opnå store ujævn nanopatterns af arginin-glycin-aspartinsyre (M.H.T.)-functionalized dendrimers, at nanoskala kontrol af lokale M.H.T. overflade tæthed. Nanopatterns er dannet af overflade adsorptionen af dendrimers fra løsninger på forskellige oprindelige koncentrationer og er karakteriseret ved vand kontakt vinkel (CA), X-ray photoelectron spektroskopi (XPS), og scanning probe mikroskopi-teknikker som scanning tunneling mikroskopi (STM) og atomic force mikroskopi (AFM). Den lokale overflade tæthed af M.H.T. måles ved hjælp af AFM billeder ved hjælp af sandsynlighed kontur kort af interparticle minimumsafstande og derefter korreleret med celle vedhæftning svar og differentiering. Metoden nanopatterning præsenteres her er en enkel procedure, der kan skaleres på en enkel måde til store arealer. Det er således fuldt ud forenelig med celle kultur protokoller og kan anvendes til andre ligander, at øve koncentration-afhængige effekter på cellerne.
Introduction
Her beskriver vi en simpel og alsidig dendrimer-baseret nanopatterning metode til at opnå celle kultur overflader, der tillader kontrol af lokale klæbeevne på nanoplan. Nanoskala detaljer af ECM organisation er blevet rapporteret,1,2,3 og nanopatterning af celle vedhæftning overflader har givet dyb indsigt i cellulære krav til vedhæftning4, 5. Eksperimenter ved hjælp af micellar litografi-baserede nanopatterns afslørede en grænseværdi på omkring 70 nm for M.H.T. peptid nanospacing, celle vedhæftning forsinkes væsentligt over denne værdi6,7,8 ,9. Disse undersøgelser også fremhævet større indflydelse af lokale end global ligand tæthed på celle vedhæftning9,10,11.
Under morfogenese udløse celle interaktioner med det omgivende miljø hændelserne første differentiering, som fortsætter indtil sidste komplekse strukturer er blevet dannet. Inden for denne ramme, har nanopatterned overflader været brugt til at tackle indflydelsen af de oprindelige celle-overflade interaktioner på morfogenese. Litografi-baserede M.H.T. nanopatterns med en lateral afstand af 68 nm i β-typen Ti-40Nb legeringer hjælp til at opretholde den udifferentierede Fænotypen af ikke-begået stamceller12, mens M.H.T. nanospacings af mellem 95 og 150 nm øge differentiering af mesenchymale stamceller (msc) mod adipogenic/osteogenic13,14,15 og chondrogenic skæbner16. Også, selvsamlende makromolekyler modificeret med signaling komponenter har vist sig at direkte celle vedhæftning og differentiering gennem nanoskala arkitektoniske regulering af signaling stikord17. I denne henseende er aflejring af dendrimers med celle-interagere fraspaltning i deres ydre kugle18,19,20 på overflader blevet brugt til at studere cellen vedhæftning21,22, morfologi23,24, og migration begivenheder25,26. Ikke desto mindre, manglen overflade karakterisering i disse undersøgelser gør det vanskeligt at etablere en sammenhæng mellem dendrimer overflade konfiguration og celle respons.
Dendrimer nanopatterns med væske-lignende ordre og definerede afstand kan opnås, når dendrimers adsorberes til lav-opkrævet overflader fra løsninger med lav ionisk styrker. 27 på grundlag af denne egenskab, her præsenterer vi en metode til at opnå store ujævn nanopatterns af M.H.T.-functionalized dendrimers på lav-opkrævet overflader, at nanoskala kontrol af lokale M.H.T. overflade tæthed. Vand kontakt vinkel (CA), X-ray photoelectron spektroskopi (XPS) og scanning probe mikroskopi teknikker (STM og AFM nanopatterns) Vis, lokale ligand tætheder kan justeres ændre den oprindelige dendrimer koncentration i opløsning. Den lokale M.H.T. overflade tæthed er kvantificeret fra AFM billeder af sandsynlighed kontur kort af interparticle minimumsafstande og derefter korreleret med celle eksperimenter. Sammenlignet med andre nanopatterning teknikker4, dendrimer-baseret nanopatterning er ligetil og nemt kan skaleres til store arealer, således at være fuldt kompatible med celle kultur applikationer. Nanopatterns bruges som bioaktive substrater til at vurdere effekten af den lokale M.H.T. overflade tæthed på celle vedhæftning28 og på chondrogenic induktion af voksne menneskers MSCs29. Vores resultater viser at M.H.T. dendrimer-baseret nanopatterns opretholde cellevækst og at celle vedhæftning er forstærket med høje lokale M.H.T. overflade tætheder. I eksperimenter differentiering mellemliggende klæbeevne af celler til substraterne begunstiget MSC kondens og tidlig chondrogenic differentiering. På grund af den lethed, med hvilken dendrimer perifere grupper kan ændres, kan metoden beskrevet her udvides yderligere til andre ECM ligander, at øve koncentration-afhængige effekter på cellerne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under udviklingen af den beskrevne protokol betragtes som en række vigtige skridt. Først henviser til nanopattern karakterisering med scanning probe mikroskopi-teknikker. For at visualisere nanopatterns, overfladen hvor mønstret er produceret skal have en ruhed værdi ligger under den gennemsnitlige diameter af dendrimers, som er omkring 4-5 nm målt af STM (figur 1B). Det bør også tages i konto, høj opløsning STM imaging er begrænset til ledende substrater, i dette tilfælde Au(111). En ophævel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Oriol Font-Bach og Albert G. Castaño for deres hjælp i dmin kvantificering. De anerkender også den avancerede digitale mikroskopi enhed ved Institut for forskning i biomedicin (IRB Barcelona) at lade forfattere optage video i deres lokaler. Dette arbejde blev støttet af netværk Biomedical Research Center (CIBER), Spanien. CIBER er et initiativ finansieret af det VI nationale f & u & jeg planen 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER handlinger, og Instituto de Salud Carlos III, med støtte fra den europæiske fond for Regionaludvikling. Dette arbejde er blevet støttet af Kommissionen for universiteter og forskning på Institut for Innovation, universiteter og Enterprise af Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Det var også finansieret af projekter OLIGOCODES (nr. MAT2012-38573-C02) og CTQ2013-41339-Pedersen, tildelt af det spanske ministerium for økonomi og konkurrenceevne, desuden til INTERREG V-A Spanien-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. anerkender finansiel støtte fra den spanske Ministeriet for økonomi og konkurrenceevne grant (nr. IFI15/00151).
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
