Summary

Méthodes alternatives In Vitro pour la détermination de l’intégrité structurale de la capside virale

Published: November 16, 2017
doi:

Summary

Méthodes de détection courantes utilisant l’amplification du génome viral sont limités par leur incapacité de discriminer infectieuses de particules non infectieuses. Le but de cet article est de fournir des protocoles détaillés pour des méthodes alternatives aider à la discrimination des particules infectieuses norovirus à l’aide de la liaison aptamère, diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique à transmission.

Abstract

Les norovirus humains exige considérablement la santé publique et pertes économiques dans le monde entier. Émergents en vitro culture avances ne sont pas encore applicables pour la détection systématique du virus. La détection du courant et les techniques de quantification, qui reposent principalement sur l’amplification des acides nucléiques, ne soient pas distinguent infectieuses de particules virales non infectieuses. Le but de cet article est de présenter des détails spécifiques sur les progrès récents dans les techniques utilisées ensemble afin d’obtenir davantage d’informations sur l’état de l’infectiosité des particules virales. Une technique consiste à évaluer la liaison d’un aptamère d’ADNsb norovirus à capsides. Aptamères ont l’avantage d’être facilement synthétisé et modifié et sont peu coûteux et stable. Une autre technique, dynamic light scattering (DLS), présente l’avantage d’observer le comportement de la capside en solution. La microscopie électronique permet pour la visualisation de l’intégrité structurale de le capsides virales. Bien que prometteurs, il y a quelques inconvénients de chaque technique, telles qu’aptamère non spécifiques à la liaison aux molécules chargées positivement de matrices de prélèvement, exigence de capside purifiée pour DLS et une sensibilité médiocre pour la microscopie électronique. Néanmoins, lorsque ces techniques sont utilisées en combinaison, le corps des données produites fournit des informations plus complètes sur l’intégrité de capside des norovirus qui peut être utilisée pour déduire l’infectiosité, information qui est essentielle pour une évaluation précise des Méthodes d’inactivation ou de l’interprétation de détection de virus. Cet article fournit des protocoles permettant d’utiliser ces méthodes pour discriminer les particules infectieuses norovirus humain.

Introduction

Norovirus humain est responsable d’un fardeau considérable de santé publique dans le monde, provoquant des maladies environ 685 millions et 212 000 décès chaque année1, à un coût en milliards de dollars2,3. Aujourd’hui, dosage et détection des norovirus implique l’amplification du génome et/ou plates-formes ligand. Le premier est généralement privilégié car il est plus sensible, fournit des renseignements quantitatifs et a généralement moins de risques de faux positifs4. Technique la plus courante norovirus détection et la quantification du génome amplification est la réaction en chaîne polymérase quantitative de la transcriptase inverse (RT-qPCR). Parce qu’il vise et amplifie un petit segment du génome humain norovirus, RT-qPCR seul n’est pas capable de distinguer les infectieuses et particules non infectieuses, comme l’ARN génomique gratuit, endommageant capsides contenant les génomes et capsides avec mortellement génomes muté/tronqué peuvent encore être amplifiées par RT-qPCR. Alors que deux nouveaux in vitro des techniques culturales pour norovirus humain5,,6 ont été signalés récemment, tous les deux encore s’appuient sur la RT-qPCR pour la quantification des virus et ne sont pas encore des méthodes de routine clinique/environnement tests pour les norovirus humains. Ainsi, la RT-qPCR demeure l’étalon-or pour les essais cliniques sur l’environnement.

Autres méthodes in vitro ont été développés afin de mieux estimer le statut infectieux des particules de norovirus. Ces méthodes peuvent être généralement classés comme ceux qui portent sur l’intégrité de la capside des norovirus et ceux évaluant l’intégrité du génome. La première approche est plus populaire. Une méthode couramment utilisée est le prétraitement RNase avant l’extraction de l’ARN génomique viral, mais cela ne tient pas compte des particules virales qui restent intactes, mais n’ont pas la capacité de lier les récepteurs/co-facteurs de l’hôte, ainsi que les particules virales qui ont muté mortellement ou ont tronqué ou légèrement endommagé génomes7. Intégrité de capside peut également être évaluée basés sur la capacité du virus à se lier aux norovirus humains co-récepteur/co-facteurs, qui est des glucides appelés antigènes de groupe de histo-sang (HBGAs). HBGAs sont présents dans les cellules épithéliales intestinales hôte dans le cadre des glycoprotéines ou glycolipides (parmi de nombreux autres tissus) et peuvent être sécrétées dans les fluides corporels comme la salive. Les bactéries entériques contenant des substances de type HBGA sur leurs surfaces ont également montrés pour lier les norovirus humains8,9,10, et ces interactions peuvent promouvoir des norovirus infection5. Le concept de base de l’utilisation de la liaison de HBGA est que seules des particules virales capables de lier le putatif du récepteur/co-factor serait capables d’infecter les cellules. Plusieurs études suggèrent que la liaison de HBGA axée sur la perle qui précède l’amplification des acides nucléiques est une méthode prometteuse pour l’infectivité discrimination11,12,13,14, 15,16. Un défi majeur au sujet de la HBGAs, c’est qu’aucun type HBGA unique ne peut lier tous les génotypes de norovirus humain. Pour y remédier, mucines gastrique, qui contient HBGAs, a été utilisé à la place des glucides HBGA purifiés dans l’intérêt de la facilité de synthèse, la cohérence et coût réduit.

Une publication récente de Moore et al. 17 a présenté un ensemble de nouvelles techniques d’estimation des norovirus humains intégrité de capside. À la place de HBGAs, Moore et al. 17 a étudié la liaison d’a globalement réactif acide nucléique aptamère (M6-2)18 et globalement réactif anticorps monoclonal (NS14)19 au traité thermiquement capsides de norovirus GII.4 Sydney (Pseudo-particules virales ou PPV) et comparait cette pour la liaison à HBGAs synthétiques. Aptamères nucléotidiques sont courtes (~ 20-80 nt) unique échoués des acides nucléiques (ADN simple brin ou ARN) qui incorporer des structures tridimensionnelles uniques en raison de leur séquence et lier une cible. Parce qu’ils sont des acides nucléiques, ils sont moins coûteux ; facilement chimiquement synthétisés, purifiée et modifiée ; et à la chaleur. Plusieurs rapports d’aptamères générés contre le norovirus existent, avec certains d’entre eux montrant large réactivité à une variété de souches18,20,21,22. A titre d’exemple, Moore et al. 17 a démontré qu’aptamère M6-2 lié à norovirus humains purifiés, assemblé capsides (VLP) et se sont comportés de la même façon à HBGA dans le recours à la capside virale pour maintenir la structure de la protéine ordre (p. ex., secondaire et tertiaire) plus élevée pour liaison de se produire. En revanche, une proportion significative de liaison VLP norovirus à anticorps NS14 resta après que capsides ont été complètement dénaturés. Évaluation de la liaison de norovirus dans l’étude de Moore et al. 17 a été réalisée selon une méthode simple, axée sur la plaque similaire à ELISA, à l’exception que les aptamères sont utilisés à la place de l’anticorps (d’où la méthode a été appelée ELASA). Cette méthode expérimentale à haut débit a été utilisée pour évaluer les effets des différents traitements sur la capside des norovirus, travail qui est utile pour comprendre le mécanisme d’inactivation virale lors de l’exposition aux facteurs de stress physiques ou chimiques. Cependant, un inconvénient de cette méthode est la plus faible sensibilité et manque de tolérance pour les contaminants associés à matrice à des niveaux supérieurs qui causent les liaisons non spécifiques par aptamères.

Moore et al. 17 a utilisé une autre méthode, diffusion de lumière dynamique (DLS), pour surveiller l’agrégation des particules virales en réponse à un traitement thermique. DLS est couramment utilisée pour évaluer la taille des nanoparticules suspensions et a été étendue aux protéines23,virus et24 25,26,27. L’intensité de la lumière diffusée par les particules en solution fluctue en fonction de la taille des particules, permettant le calcul du coefficient de diffusion, puis diamètre des particules à l’aide de formules bien établies. La technique DLS peut distinguer le diamètre hydrodynamique des particules dispersées à l’échelle nanométrique, qui permet de détecter des virus dispersées, protéines de la capside individuels ou dimères et agrégats de virus basés sur la taille27. Agrégation de virus, représentée par une augmentation de la taille des particules, est révélateur de la perte d’intégrité de la capside. La capside est dénaturée et perturbée de sa structure, résidus hydrophobes deviennent exposées et entraîner les particules à se serrer les coudes et forment des agrégats. Listes de distribution peut être utilisé pour mesurer la taille des particules après un traitement précis ou la cinétique d’agrégation en temps réel17,28. Cette méthode a l’avantage de permettre l’observation du comportement de la capside en solution mais requiert des concentrations élevées de capside purifiée, qui n’est peut-être pas tout à fait représentatives du virus dans son état naturel.

La dernière méthode utilisée par Moore et al. 17 a : microscopie électronique à transmission (TEM). Bien que cette méthode manque de sensibilité et ne produit pas de données quantitatives, il permet la visualisation des effets des différents traitements sur la structure de la capside virale. Bien que pas encore idéal pour les paramètres cliniques et environnementales, l’utilisation de ces méthodes en combinaison est utile dans la compréhension de l’inactivation des norovirus humain. Le but de cet article est de fournir des protocoles approfondies pour l’analyse de la liaison basée sur un plaque (ELASA), DLS, et les méthodes de préparation de TEM utilisées pour étudier les effets des traitements thermiques sur la capside des norovirus dans le contexte des effets des traitements sur la capside intégrité, tel que présenté dans Moore et al. 17.

Protocol

1. essai de Binding reposant sur la plaque pour évaluer perte de plus élevés ordre Norovirus capside Structure Remarque : un protocole ELASA très similaire à celui présenté ici a été publié 29, et similaires ELASA tests précédemment ont été signalés comme partie de la recherche les articles ailleurs 17 , 18 , 22. Du traitement the…

Representative Results

L’intégrité structurale des capsides de norovirus humain GII.4 Sydney (VLP) a été évaluée à l’aide de plusieurs méthodes novatrices présentées par Moore et al. 17. tout d’abord, il a été faite une expérience dans laquelle l’intégrité des capsides en fonction de leur capacité à lier un putatif du récepteur/co-factor (HBGA) ou aptamère d’ADN simple brin (M6-2) ont été comparé (Figure 1). Les résu…

Discussion

Le protocole et les techniques décrites ici constituent un moyen d’évaluer les norovirus humains capside intégrité/fonctionnalités. Ces méthodes peuvent être utilisés pour l’obtention de mécaniste dans les effets de l’inactivation des traitements contre le virus et potentiellement peuvent compléter les méthodes d’évaluation inactivation plus traditionnels tels qu’essai RT-qPCR ou plaque. Par exemple, l’évaluation de l’inactivation chimique ou physique par des essais de plaque seul fournit une m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l’Agriculture and Food Research Initiative compétitive Grant no 2011-68003-30395 du United States Department of Agriculture, Institut National de l’alimentation et l’Agriculture à travers le projet NoroCORE. Frais d’accès ouvert a été financé par l’United States Department of Agriculture. Nous tenons à remercier Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) de bien vouloir nous les capsides purifiées et Valerie Lapham pour son aide avec les images TEM. Nous tenons également à remercier Frank N. Barry pour nous aider à commencer les expériences présentées.

Materials

Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure
96-well, medium-binding polystyrene EIA plate Fisher (Costar) 07-200-36
Lid for 96-well plate Thermo Fisher 3098
Paraffin film (Parafilm) Thermo Fisher PM999
1x PBS (pH 7.2) Life Technologies 20012-050
Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 N/A N/A
Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids N/A N/A
Individual 0.2 ml PCR tubes Genesee Scientific 22-154G
2 thermocyclers Bio-Rad 1861096
Tabletop mini centrifuge Fisher Scientific 12-006-901
Skim milk solids Thermo Fisher LP0031B
Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated Glycotech 01-017
Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 Life Technologies SNN2004
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature Thermo Fisher 50-76-00
1 M phosphoric acid N/A N/A
Microplate reader capable of reading 450 nm Tecan Infinite m200 Pro
Name Company Catalog Number Comments
Analysis of Plate-Based Assay Results
Microsoft Excel or similar program N/A N/A
Name Company Catalog Number Comments
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument Malvern Instruments N/A
Vortex Fisher Scientifc 02-215-365
Quartz cuvette Hellma 104-002-10-40
Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) Malvern Instruments ZEN0040
Name Company Catalog Number Comments
Transmission Electron Microscopy Sample Preparation
Nickel electron microscopy grids with carbon support film Ladd Research 10880-100
Self-closing reverse electron microscopy tweezers Ted Pella 5372-NM
Qualitative filter paper Sigma-Aldrich (Whatman) WHA1002055
Glass petri dishes Sigma-Aldrich BR455743
100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) N/A N/A
2% uranyl acetate N/A N/A

References

  1. Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
  2. Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
  3. Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
  4. Law, J. W. -. F., Ab Mutalib, N. -. S., Chan, K. -. G., Lee, L. -. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell – derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
  7. Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -. A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
  8. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  9. Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
  10. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
  11. Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
  12. Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
  13. Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
  14. Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
  15. Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
  16. Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
  17. Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
  18. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -. A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
  19. Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
  20. Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
  21. Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
  22. Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -. A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
  23. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not?. Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
  24. Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
  25. Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
  26. Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
  27. Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
  28. Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
  29. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -. A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
  30. Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
  31. Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
  32. Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
  33. Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
  34. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  35. Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
  36. Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
  37. Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).

Play Video

Cite This Article
Moore, M. D., Mertens, B. S., Jaykus, L. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (129), e56444, doi:10.3791/56444 (2017).

View Video