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화학

Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

Published: March 01, 2018
doi:
10.3791/56445
, , , ,
1School of Public Health of Southeast University,Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering,Southeast University, 3School of Public Health,Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy,Nanjing Foreign Language School

Summary

Apresentamos uma conveniente extração de fase sólida acoplada a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com deteção eletroquímica (ECD) para a determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina e dois dos seus metabolitos na urina dos bebês. Também identificamos o metabólito MHPG como um potencial biomarcador para o diagnóstico precoce de lesões cerebrais para infantes.

Abstract

A extração e a análise dos neurotransmissores catecolaminas em fluidos biológicos é de grande importância na avaliação da função do sistema nervoso e doenças relacionadas, mas sua medida precisa ainda é um desafio. Muitos protocolos têm sido descritos para medição do neurotransmissor por uma variedade de instrumentos, incluindo cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). No entanto, existem deficiências, tais como a operação complicada ou difícil de detectar alvos múltiplos, que não podem ser evitados, e atualmente, a técnica de análise dominante é ainda HPLC acoplado com sensível eletroquímico ou detecção de fluorimétrica, devido a sua sensibilidade elevada e boa seletividade. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para o pré-tratamento e a detecção de catecolaminas com cromatografia líquida de alta pressão com deteção eletroquímica (HPLC-ECD) em amostras de urina real dos lactentes, usando electrospun de nanofibras composto composto de éter de coroa poliméricas de poliestireno como adsorvente, também conhecido como o método de extração (PFSPE) embalado-fibra de fase sólida. Mostramos como urina amostras podem ser facilmente precleaned por uma coluna de fase sólida nanofibras-embalados, e como os analitos na amostra podem ser rapidamente enriquecidos, em estudo dessorvida e detectado em um sistema ECD. PFSPE simplifica os procedimentos de pré-tratamento de amostras biológicas, permitindo a diminuição do tempo gasto e redução da perda de alvos.

Em geral, este trabalho ilustra um protocolo simples e conveniente para a extração de fase sólida acoplada a um sistema de HPLC-ECD para determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) e dois de seus metabólitos (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) e ácido 3,4-diidroxi-fenilacético (DOPAC)) na urina dos bebês. O protocolo estabelecido foi aplicado para avaliar as diferenças de catecolaminas urinárias e seus metabolitos entre lactentes de alto risco com uma lesão cerebral perinatal e controles saudáveis. Análise comparativa revelou uma diferença significativa entre os dois grupos, indicando que os metabólitos de catecolaminas podem ser um marcador de candidato importante para o diagnóstico precoce dos casos em risco de danos cerebrais em crianças em MHPG urinário.

Introduction

Os neurotransmissores catecolaminas e seus conteúdos metabolito em fluidos corporais podem afetar a função neural e afetam o equilíbrio dos Estados de estímulo-resposta-à uma extensão grande1. Abnormities pode causar uma variedade de doenças, tais como pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma e distúrbios neurológicos1,2. A extração e a determinação de catecolaminas em fluidos corporais é significativo para o diagnóstico das doenças relevantes. No entanto, catecolaminas em amostras biológicas existem em baixas concentrações e são facilmente oxidadas. Além disso, eles são muito difíceis de eluir devido à grande quantidade de interferência no médio3. Assim, a deteção simultânea de catecolaminas em fluidos biológicos ainda é um desafio.

Tem havido comentários mostrando que catecolaminas urinárias podem ser uma medida de stress, e que seus níveis são importantes marcadores biológicos respondendo à estimulação tátil processamento em recém-nascidos5. De acordo com a pesquisa, todas as crianças que sofreram de incidentes prematuros correm risco de lesão de cérebro a4,5,6, e lesão pode causar anormal liberação de catecolaminas e assuntos afins para os fluidos. Existem técnicas avançadas de ressonância magnética que podem detectar danos cerebrais em anteriores fases7,8. No entanto, dentro as primeiras 48 horas, um processo de desenvolvimento neurológico anormal causará danos cerebrais permanentes que não será evidente em imagens médicas11. Além disso, os recursos de alto custo e escassos instrumento, juntamente com outros fatores, torna impossível para todas as unidades neonatais ter acesso a estas técnicas especializadas de neuro-imagem. No entanto, o uso de um biomarcador facilmente acessível e prático (como catecolaminas e seus metabólitos) poderia superar estas deficiências, e a seleção de um biomarcador em fluidos humano pode ajudar no diagnóstico precoce de lesão cerebral e levar a solicitar identificação dos infantes recém-nascidos necessitam de neuroproteção9. As catecolaminas na urina podem ser um índice de fácil e óbvio, devido a correlação direta entre a quantidade deles lançado em fluidos e neuroactivity função.

Entre os fluidos biológicos, líquido cerebrospinal (CSF) e amostras de plasma não são fáceis de obter através de procedimentos traumáticos existentes, e também é muito difícil se livrar de interferência devido a proteína adesiva e outras impurezas, levando a uma incômoda e processo de amostragem demorada que é inadequado para a deteção repetida. Além disso, para as crianças, é quase impossível conseguir as amostras de forma traumática. Portanto, a amostragem urinária é melhor do que as outras formas de amostragem, como é não-invasivo, fácil de operar e pode ser feito repetidamente. Amostras de urina são abundantes e fáceis de armazenar e mostrar grandes vantagens sobre as outras formas de amostras biológicas.

Os principais métodos para quantificar as catecolaminas em fluidos biológicos incluem ensaios de radioenzymic10, ensaios imune-adsorvente enzima-lig11, voltametria12 e lente térmica espectrometria13. Mas existem deficiências, tais como operações complicadas e difíceis de detectar alvos múltiplos. Hoje, a técnica de análise dominante é a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)14, juntamente com o sensível eletroquímica15 ou fluorimétrica deteção16, devido à sua alta sensibilidade e seletividade de boa. Com a tecnologia de espectrometria de massa em tandem, tais como cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS) e espectrometria de massa cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS/MS), a análise e quantificação dos neurotransmissores podem alcançar alto precisão e especificidade17,18. No entanto, a técnica requer instrumentação cara, bem como mão de obra qualificada substancialmente, dificultando o método a aplicar-se universalmente em laboratórios mais convencionais. Sistemas de HPLC-ECD são comumente equipados em laboratórios clínicos e mais convencionais e tornaram-se assim uma escolha comum e bom para grupos de pesquisa a ser usado para determinação de química, mas eles exigem a amostra introduzida no sistema para ser limpo e de microescala volume19. Assim, é de grande importância para purificar e condensar a amostra antes da análise. O método clássico para a etapa de purificação é extração líquido-líquido14,15,20 e off-line extração de fase sólida, incluindo alumina ativada coluna21,22 e diphenylborate (DPBA) complexação23,24,25,26.

Myeongho Lee et al . Tenho vindo a utilizar resina de polímero quimicamente modificada com éter de coroa como o adsorvente para extrair seletivamente catecolaminas de urina humana desde 200727. Além disso, em 2006, que Haibo et al. demonstrou uma abordagem de síntese facile para boronate afinidade extração adsorvente byutilizing um nanomagnetic functionalizable silsesquioxane oligoméricas poliédrico (POSS) composto de nanomagnetic com base e aplicando-a para o enriquecimento de catecolaminas em urina humana (noradrenalina, adrenalina e isoproterenol)28. Eles também aproveitaram os nanomateriais para cumprir o trabalho, usando uma tecnologia chamada nano-eletrofiação e formando o material fibroso de polímero em nanoescala. O processo de eletrofiação pode ajustar o diâmetro, morfologia e alinhamento espacial do produto, controlando a tensão de funcionamento e alterando o conteúdo da solução de fiação, juntamente com outros parâmetros,29. Comparado com o cartucho convencional do SPE, electrospun Nanofibras são altamente apropriadas extrair e enriquecer os analitos de destino de uma matriz complexa, como são equipados com elevados rácios de superfície-área-volume para adsorver substâncias a analisar com eficiência elevada, e apresentam mais facilmente controlado superfície químicas Propriedades, permitindo que o apego à mão dos compostos alvo. Estas propriedades fazem-lhes boas escolhas para adsorventes SPE, reduzindo a fase sólida e a dessorção solvente quantidade30,31,de32,33. Para catecolaminas em amostras de urina, electrospun nanofibras compostas de éter de coroa apolymeric com poliestireno (PCE-PS) foram usadas para extrair seletivamente três catecolaminas (NE, E e DA)34. O jornal indicou que o éter de coroa seletiva adsorvido os destinos do NE, E e DA, que foi baseada na sua geometria correta para a vinculação de catecolaminas através de formando ligações de hidrogênio. Os resultados exibidos o éter coroa material efetivamente, remoção de outros compostos interferentes contidos em amostras biológicas. Inspirado por este relatório, um novo método foi desenvolvido para a extração seletiva das catecolaminas pelo uso de electrospun de nanofibras composto composto do PCE-PS.

Neste trabalho, o método relatado anteriormente34 foi melhorado e empregados não só para analisar com êxito E, NE e o pai, mas também seus metabolitos, MHPG e DOPAC, na urina. Podemos também explorar novas possibilidades para o mecanismo do processo de adsorção. O método mostra satisfatória eficiência de extração e seletividade para os cinco analitos, e o método foi verificado na análise da urina de bebês de alto risco com uma lesão cerebral perinatal e controles saudáveis.

Protocol

Foi obtido consentimento dos pais, e aprovação do Conselho de revisão institucional foi obtida para o estudo. O estudo foi realizado em conformidade com o código de ética da associação médica mundial (declaração de Helsinque) para experimentos envolvendo seres humanos. Cuidadores de todos os participantes fornecidos autorização por escrito para serem incluídos no estudo. Aprovação do Comitê de ética do Hospital de Zhongda, afiliado com a Universidade do sudeste, obteve-se também. <p class="jove_titl…

Representative Results

Este protocolo é um método PFSPE simples e conveniente para pré-tratamento de amostras de urina e enriquecer cinco catecolaminas para a deteção através de um sistema de HPLC-ECD; um diagrama do processo é mostrado na Figura 1. O protocolo inclui principalmente quatro etapas-ativando, carregamento, lavagem e farmacológicos – juntamente com uma pequena quantidade de nanofibras de PCE-PS e um dispositivo simples extração de fase sólida. A morfologia d…

Discussion

O método PFSPE proposto neste trabalho pode ser significativo e significativo no que diz respeito a sua rapidez, simplicidade e conveniência. Os adsorventes usados no protocolo são electrospun de nanofibras, que têm altos superfície rácios de área e o volume e adsorver substâncias a analisar com eficiência elevada. O procedimento só precisa de alguns miligramas de nanofibras e um pequeno volume de solvente eluente e não requer uma etapa de evaporação para concentrar os analitos. Aqui, apresentamos uma visão…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi suportado por nacional Science Foundation da China (No.81172720, n. º 81673230), o programa de investigação Social desenvolvimento de Jiangsu província ciência e departamento de tecnologia (n. º BE2016741), ciência & tecnologia projeto da China a administração geral de supervisão da qualidade, inspeção e quarentena (2015QK055), o programa de abrir projeto de laboratório chave de desenvolvimento infantil e aprendizagem das Ciências do Ministério da educação, Universidade do Sudeste (CDLS-2016-04). Sinceramente, reconhecemos canção Yuan e Ping Liu, que nos ajudaram na recolha de amostras.

Materials

200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 
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Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).
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