Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für ganze Berg Immunfluoreszenz und Image-basierten quantitativen volumetrische Analyse der frühen Stadium Mausembryonen. Wir präsentieren diese Technik als ein leistungsfähiger Ansatz qualitativ und quantitativ kardialen Strukturen während der Entwicklung zu bewerten, und schlagen vor, dass es möglicherweise sehr anpassungsfähig an andere Organsysteme.
Abstract
Der Einsatz von bildgebenden Verfahren ständig fortschreitende hat im großen und ganzen zu unserem erhöhten Verständnis der embryonalen Entwicklung beigetragen. Vor der Implantation Entwicklung und Organogenese sind zwei Bereiche der Forschung, die stark von diesen Fortschritten, aufgrund der hohen Qualität der Daten profitiert haben, die direkt von imaging Embryonen vor der Implantation oder ex Vivo Organe gewonnen werden können. Vor der Implantation Embryonen Daten mit besonders hoher räumlicher Auflösung ergeben haben, aber spätere Phasen dreidimensionale Rekonstruktion weniger zugänglich waren. Gewinnung von qualitativ hochwertige 3D oder volumetrische Daten für bekannten embryonale Strukturen in Kombination mit Schicksal Mapping oder genetischen Abstammung Ablaufverfolgung ermöglicht eine umfassendere Analyse der morphogenetischen Veranstaltungen statt in der Embryogenese.
Dieses Protokoll beschreibt einen ganze-Mount Immunfluoreszenz-Ansatz, der zur Kennzeichnung, Visualisierung und Quantifizierung der Stammvater Zell-Populationen innerhalb der entwickelnde kardiale Halbmond, ermöglicht eine zentrale Struktur im Herzen Entwicklung gebildet. Der Ansatz ist so gestaltet eine Weise, die beide Zellen und Gewebe-Ebene Informationen abgerufen werden können. Konfokale Mikroskopie mit Bildverarbeitung, ermöglicht dieses Protokoll für dreidimensionale räumliche Rekonstruktion der kardialen Mondsichel, wodurch die Möglichkeit, die Lokalisierung und die Organisation der bestimmte Vorläuferzellen Bevölkerungen während analysieren dieser kritischen Entwicklungsphase Herz. Wichtig ist, ermöglicht die Verwendung von Referenz-Antikörper für aufeinanderfolgende Maskierung der kardialen Mondsichel und quantitative Messungen der Bereiche innerhalb des Halbmonds. Dieses Protokoll ermöglicht nicht nur eine detaillierte Untersuchung der frühen Entwicklung des Herzens, aber mit Anpassungen auf die meisten Organsysteme in der Gastrula zu frühen Somiten Bühne Mausembryos anwendbar sein sollte.
Introduction
Die Studie der Organogenese hat lange auf die Beobachtung der morphogenetischen Veranstaltungen im sich entwickelnden Embryo verlassen. Diese Studien setzen häufig auf die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen oder Abstammung Ablaufverfolgung Reporter in Kombination mit Kennzeichnung der definierten Populationen. 1 durch den Vergleich der relativer Positionen der diese Etiketten, kann Informationen über die Herkunft, die Bewegung oder die ultimative Beitrag einer Bevölkerung von Interesse zu entnehmen. Transplantation und Schicksal Zuordnung Experimente verwenden morphologischen Sehenswürdigkeiten oder Injektion von Farbstoffen in nicht-bewegliche Linien den Ausgangspunkt der Zellen von Interesse, zu definieren, die dann für Verdienste um die entwickelten Embryo untersucht werden. 2 , 3 , 4 , 5 genetische Abstammung-Ablaufverfolgung Experimente benutzen das gleiche Konzept mit klar definierten Reporter Allele, die Label-Zell-Populationen ohne experimentelle Manipulation verwendet werden. Schlüssel zu dieser Ansätze ist die Fähigkeit, mit hoher räumlicher Auflösung, die Standorte des experimentellen und Referenz-Etiketten zu bestimmen. Diese Ansätze haben herausragende Fortschritte bei der Entwicklung vor der Implantation erbracht und explant Organogenese Studien. 6 , 7 , 8 , 9
Die entwicklungspolitische Ereignisse, die Herzen Morphogenese zugrunde liegen haben in den letzten Jahren zunehmend gut beschrieben. 10 eine der großen Entdeckungen in diesem Bereich der Forschung ist die Beschreibung einer Reihe von Vorläuferzellen Populationen, die durch Ausdruck der einzigartigen Markierungen unterschieden werden können. 11 diese Populationen sind die erste und zweite Herz-Felder (FHF und SHF), die innerhalb der kardialen Halbmond an der vorderen Seite des Embryos an embryonalen Tag (E) 8,25 Maus Entwicklung vorhanden sind. 12 diese Populationen werden häufig durch eine Kombination von Weitfeld-Mikroskopie, die Gewebe-Ebene Informationen und seriellen Schnitt Immunofluoreszenz Tests bietet, untersucht, die zelluläre hochauflösende aber nur bietet zweidimensionaler räumlicher Informationen. 13 so während dieser Studien stark unser Verständnis von Herzen Entwicklung fortgeschritten haben die verfügbaren Methoden haben begrenzte in Tiefe Quantitative Analyse der Morphogenese während dieser Phasen, schaffen die Notwendigkeit für Ansätze zu prüfen, die Organisation dieser Populationen auf der Ebene des gesamten Organismus.
Die jüngsten Fortschritte in der konfokalen Mikroskopie und 3D-Bildanalyse ermöglichen für hochauflösende und Hochdurchsatz-algorithmische Rekonstruktionen von Zellen und Strukturen in Situ mit relativer Leichtigkeit, so ebnet den Weg für detaillierte Studien des Komplexes Zellstrukturen. 14 mit der Erhöhung der Rechenleistung und der Entwicklung von big Data Geschäftsführer Algorithmen, notwendig zu handhaben die exponentielle Zunahme der Größe der imaging-Daten-Sets, können Analysen jetzt vollständig automatisiert werden. 15 automatisierte Analyse von bildgebenden Datensätzen hat den Vorteil des Seins, unvoreingenommen, aber es ist nur so zuverlässig wie die Qualität des Eingabedatasets; Es ist zwingend notwendig, dann, dass Best Practices beim Erwerb und Bildvorverarbeitung verwendet werden, um die höchste Qualität, unvoreingenommene Analyse zu gewährleisten. 16 können Protokolle vollständig automatisiert und für Reproduzierbarkeit freigegeben, und die von proprietärer Software verwendeten Algorithmen sind leicht über Bibliotheken von Wissenschaftlern verwendet werden, die Vertrautheit mit modernen proprietär oder Open-source Entwickler-Tools. 17
Das folgende Protokoll erklärt die notwendigen Schritte, um eine solche Analyse auf ein definiertes Modell der Organogenese, die Bildung der kardialen Mondsichel bei Herz-Entwicklung durchführen. Insbesondere dieses Protokoll beschreibt, wie Sie (1) ernten und kardiale Halbmond Embryonen zu sezieren, (2) führen Sie ganze Berg Immunfluoreszenz als Referenz (Nkx2-5) und experimentellen (Foxa2Cre:YFP18,19) Marker, (3) vorbereiten und die Embryonen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, image und schließlich (4) zu analysieren und zu quantifizieren die dabei entstandenen Bilder mit erweiterten dreidimensionale Ansätze. Während der kardialen Halbmond als Beispiel hier, bei entsprechender Modifikation verwendet wird kann dieses Protokoll für die Analyse von mehreren Linien in Gastrula zu frühen Somiten Embryonen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das obige Protokoll beschreibt eine Strategie für den Erhalt der quantitativer Daten aus ganzen Berg Immunfluoreszenz Bilder in hoher Qualität von Mäuseembryonen nach der Implantation. Wenn richtig durchgeführt, können die 3D volumetrischen Daten generiert durch diese Schritte für vergleichende und intersektionale Analyse von mehreren Domains innerhalb des Embryos verwendet werden. Die Oberfläche Signal Maskierung beschriebene Ansatz ist besonders nützlich bei der Untersuchung von neuartigen Zellpopulationen im V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH/NHLBI R56 HL128646 und dem Mindich Child Health and Development Institute (MCHDI) am ISMMS (, N.D.) finanziert. E.b. wird unterstützt durch ein NIH/NIDCR Praktikum T32 HD075735. Mikroskopie und Bildanalyse erfolgte der Mikroskopie Kern an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai, die teilweise vom Tisch Cancer Institute am Mount Sinai P30 CA196521 – Cancer Center Support Grant unterstützt wird.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
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