Une Technique de Squash de tube séminifère pour l’analyse cytologique de la spermatogenèse en utilisant le modèle de souris
Summary
L’objectif de cette technique de courge tubule est d’évaluer rapidement les caractéristiques cytologiques de mettre au point les spermatocytes de souris tout en préservant l’intégrité cellulaire. Cette méthode permet l’étude de toutes les étapes de la spermatogenèse et peut être facilement mis en œuvre aux côtés d’autres approches biologiques biochimiques et moléculaires pour l’étude de la méiose de souris.
Abstract
La progression méiotique chez les mâles est un processus qui exige l’action concertée d’un certain nombre d’événements cellulaires très réglementés. Erreurs qui se produisent au cours de la méiose peuvent mener à l’infertilité, perte de grossesse ou des anomalies génétiques. Commençant au début de la puberté et tout au long de l’âge adulte, des ondes continues semi-synchrone des spermatocytes subissent la spermatogenèse et finalement forment les spermatozoïdes haploïdes. La première vague des spermatocytes de souris en cours de méiose initiation apparaissent au jour 10 après l’accouchement (10 dpp) et sont libérés dans la lumière des tubules séminifères comme les spermatozoïdes matures à 35 dpp. Par conséquent, il est avantageux d’utiliser des souris dans cette fenêtre de temps du développement afin d’obtenir des populations fortement enrichies d’intérêt. Analyse des étapes de rares cellules est plus difficile chez les souris âgées grâce à l’apport de la spermatogenèse vagues successives, qui augmentent la diversité des populations cellulaires dans les tubules. La méthode décrite ici est une technique facilement mis en œuvre pour l’évaluation cytologique des cellules trouvées dans les tubules séminifères des souris, y compris les spermatogonies, les spermatocytes et les spermatides. La technique de courge tubule maintient l’intégrité des cellules germinales des mâles isolés et permet l’examen des structures cellulaires qui ne sont pas facilement visualisés avec d’autres techniques. Pour illustrer les applications possibles de cette technique de courge tubule, l’axe a été suivie dans les spermatocytes progresse par le biais de la prophase à la métaphase qu’i de transition (transition G2/MI). En outre, duplication du centrosome, inactivation méiotique des chromosomes sexuels (MSCI) et formation de bouquet de chromosomes ont été évalués comme exemples des structures cytologiques que l’on peut observer à l’aide de cette méthode de squash du tubule. Cette technique peut servir à repérer les défauts spécifiques au cours de la spermatogenèse qui résultent de la mutation ou perturbations exogènes, et contribue ainsi à notre compréhension moléculaire de la spermatogenèse.
Introduction
La méiose est un événement cellulaire complexe dans lequel un rond simple de réplication de l’ADN est suivi de deux cycles successifs de la division cellulaire. Plusieurs événements spécifiques à la méiose doivent être coordonnés au cours des stades de la méiose pour assurer la ségrégation des chromosomes précis. Ces événements comprennent l’achèvement de la recombinaison, orientation Co de sœur kinétochores au cours de la première division méiotique et la perte progressive des cohesin complexes pour résoudre les chiasmes entre homologues. Régulation précise de ces processus est nécessaire pour maintenir la fertilité et d’empêcher les événements de missegregation de chromosomes qui peuvent conduire à des troubles du développement génétiques et une fausse couche1.
Tandis que les principaux événements de la méiose ont lieu chez les mâles et les femelles, des différences temporelles et mécanistes significatives existent entre la spermatogenèse et l’ovogenèse2. Par exemple, au cours de la méiose femelle, prophase I se produit durant le développement embryonnaire et arrête au stade de la dictyate jusqu’à la puberté. En revanche, la spermatogenèse débute à la puberté et progresse dans les vagues tout au long de la vie d’adulte sans arrêt. Les différences entre mâle et femelle de la méiose met l’accent sur la nécessité de développer des méthodes qui sont spécifiquement pris en charge vers l’évaluation de ces processus dans les spermatocytes et les ovocytes. Actuellement, évaluer la progression méiotique en grande partie repose sur l’utilisation de la chromatine se propage3,4,5. Alors que les écarts de la chromatine sont utiles pour étudier les chromosomes méiotiques, ils ne parviennent pas à préserver l’intégrité cellulaire, empêchant l’évaluation des structures cellulaires tels que les microtubules du fuseau, centrosomes, l’enveloppe nucléaire et pièces jointes télomère. Imagerie en direct et des techniques de culture à long terme ont grandement contribué à améliorer notre compréhension de la méiose femelle ; des approches similaires pour visualiser toute la cellule intacte, cependant, sont moins fréquemment mis en oeuvre pour l’étude de la spermatogenèse6,7. Afin de visualiser les événements dynamiques tout au long de la méiose mâle, nous avons adapté des techniques de courge tubule établies pour évaluer rapidement les caractéristiques cytologiques de développer souris spermatocytes8,9. La méthode décrite ici préserve l’intégrité de la cellule, permettant l’étude des multiples structures cellulaires au cours de différentes étapes de la spermatogenèse.
Cette technique de courge tubule est une approche de cellules entières, ce qui permet pour l’évaluation des structures cellulaires par l’intermédiaire de la microscopie par immunofluorescence. Les approches histologiques communes de visualiser la progression méiotique chez les souris mâles comme hématoxyline et éosine coloration des testicules de paraffine incorporé, en les étiquetant par immunofluorescence des cryosections permettent une vue d’ensemble de la progression de la méiose. Toutefois, ces techniques ne parviennent pas à résoudre les cellules individuelles dans la mesure nécessaire pour une analyse détaillée des événements qui se produisent tout au long de la méiose10,11. Des techniques alternatives de visualiser les processus méiotiques dépendent de perturbation significative chimiosmotique le spermatocyte pour isoler et fixer les matières nucléaires3,4,5. Ces traitements chimiques empêchent l’observation des types de cellules autres que les spermatocytes primaires. Une méthode décrite récemment par Namekawa a permis à la communauté des chercheurs afin de préserver l’architecture nucléaire des spermatocytes isolés, mais nécessite l’utilisation d’un cytospin et accessoires qui ne sont peut-être pas facilement disponibles pour certains laboratoires4. En revanche, la technique de courge tubule requiert seulement l’équipement qui est généralement standard dans la plupart des laboratoires de biologie cellulaire.
La méthode de courge tubule décrite ici permet de visualiser les types de cellules diverses trouvées dans le tube séminifère, y compris les cellules de sertoli, spermatogonies, spermatocytes primaires et secondaires et les spermatides. En couplant cette technique avec la première vague près-synchrone de la spermatogenèse chez les jeunes souris, il est possible d’obtenir des populations enrichies de cellules spermatogéniques mesure qu’ils progressent à travers la méiose12. Ce processus permet l’analyse détaillée des processus tout au long de la spermatogenèse, tels que les événements précoces de la prophase, le G2/MI et métaphase aux transitions de l’anaphase et la spermiogenèse. En outre, les préparations tubule peuvent être utilisées pour visualiser les caractéristiques cytologiques des chromosomes (par exemple les domaines proposition (DCI) et les kinétochores) et les centrosomes (centrioles et péricentriolaire matériel/matrices). La méthode de courge peut être facilement effectuée en parallèle avec d’autres approches expérimentales, telles que la chromatine se propage et extraction de protéine. En outre, cette technique a été correctement modifiée pour déposer les cellules spermatogéniques vivantes sur les diapositives pour visualisation directe13.
La méthode décrite ici implique une technique de squash de tube séminifère germes entiers afin d’analyser la transition G2/MI chez les souris C57BL/6J de type sauvage. Les caractéristiques cytologiques de spermatocytes primaires entrant dans la première division méiotique ont été visualisés à l’aide de la microscopie par immunofluorescence pour observer le fuseau méiotique. Cette technique polyvalente peut être facilement modifiée pour visualiser les autres stades de la méiose et les différents types de cellules. La technique est également susceptible de stratégies alternatives de visualisation, comme les approches d’ADN et ARN poisson.
Protocol
Representative Results
Discussion
Souris ont prouvé d’être un organisme modèle utile pour étudier les événements cellulaires qui régissent la méiose progression au cours de la spermatogenèse. En outre, il est nécessaire de développer des outils pris en charge à l’étude de la spermatogenèse parce que beaucoup d’événements, tels que sortir de la prophase méiotique, j’ai, sont sexuellement dimorphe. Ce protocole décrit une méthode de courge tube séminifère pour la visualisation et l’étude des différentes étapes de la sperma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIGM (R01GM11755) à P.W.J. et une bourse de subvention de formation de l’Institut National de Cancer (NIH) (CA009110) à S.R.W. et J.H.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
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