Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell
Summary
Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.
Abstract
Meiotische Progression bei Männern ist ein Prozess, der die konzertierte Aktion eine Reihe von stark regulierten zelluläre Ereignisse erfordert. Während der Meiose auftretende Fehler können zu Unfruchtbarkeit, Schwangerschaftverlust oder Gendefekte führen. Beginnend mit dem Beginn der Pubertät und während der gesamten Erwachsenenalter, kontinuierliche halbsynchrone Wellen von Spermatozyten Spermatogenese zu unterziehen und letztlich bilden haploide Spermien. Die erste Welle der Maus Spermatozyten unterziehen meiotische Einleitung erscheinen am 10. Tag Post-Partum (10 Dpp) und in das Lumen der seminiferous Röhrchen als reifes Sperma auf 35 Dpp freigesetzt werden. Daher ist es vorteilhaft, Mäuse innerhalb dieser Entwicklungsstörungen Zeitfenster zu nutzen, um hoch angereicherten Populationen von Interesse zu erhalten. Analyse der seltenen Zelle Stadien ist schwieriger bei älteren Mäusen aufgrund des Beitrags von aufeinanderfolgenden spermatogenic Wellen, die die Vielfalt der zellularen Bevölkerungen innerhalb der Tubuli zu erhöhen. Die hier beschriebene Methode ist eine leicht implementierte Technik für die zytologische Auswertung der Zellen innerhalb der seminiferous Röhrchen von Mäusen, einschließlich Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatids gefunden. Die Röhrchen Squash Technik bewahrt die Integrität der isolierten männlichen Keimzellen und ermöglicht die Untersuchung der zellulären Strukturen, die mit anderen Techniken nicht einfach visualisiert werden. Um die Anwendungsmöglichkeiten dieser Röhrchen-Squash-Technik zu demonstrieren, wurde Spindel Montage in Spermatozyten voran durch die Prophase, Metaphase, die ich Übergang (G2/MI Übergang) überwacht. Darüber hinaus wurden Centrosome Vervielfältigung, meiotische Geschlechtschromosomen Inaktivierung (MSCI) und Chromosom Blumenstrauß Bildung als Beispiele der zytologischen Strukturen beurteilt, die mit dieser Röhrchen-Squash-Methode beobachtet werden können. Diese Technik kann verwendet werden, um bestimmte Mängel während der Spermatogenese aufzeigen, die durch Mutation oder exogene Störung verursacht werden und trägt somit zum molekularen Verständnis der Spermatogenese.
Introduction
Meiose ist ein komplexes zellulären Ereignis, in dem eine einzelne Runde der DNA-Replikation von zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung gefolgt. Meiose-spezifische Veranstaltungen müssen während der Anfangsphase der Meiose zu gewährleisten genaue Chromosom Abtrennung koordiniert werden. Diese Ereignisse gehören der Abschluss der homologen Rekombination, Co Ausrichtung der Schwester Kinetochore während die erste meiotische Teilung und der schrittweise Verlust der Cohesin-komplexe, Chiasmata zwischen homologen zu lösen. Präzise Regulation dieser Prozesse ist notwendig, um die Fruchtbarkeit zu erhalten und Chromosom Missegregation Ereignisse zu verhindern, die zu genetischen Entwicklungsstörungen und spontanen Fehlschlag1führen können.
Während die wichtigsten Ereignisse der Meiose in Männchen und Weibchen stattfinden, bestehen erhebliche zeitliche und mechanistische Unterschiede zwischen Spermatogenese und Oogenese2. Zum Beispiel, während der weibliche Meiose, Prophase I tritt während der Embryonalentwicklung und Verhaftungen in der Dictyate-Phase bis zur Pubertät. Im Gegensatz dazu beginnt Spermatogenese um Pubertät und schreitet in Wellen im gesamten Erwachsenenlebens ohne Haftbefehl. Die Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Meiose betont die Notwendigkeit, Methoden zu entwickeln, die speziell zur Beurteilung dieser Prozesse in Spermatozyten und Eizellen gesorgt werden. Derzeit beruht weitgehend meiotic Progression Beurteilung auf der Verwendung von Chromatin breitet sich3,4,5. Während Chromatin breitet sich nützlich für das Studium meiotische Chromosomen sind, Scheitern sie Erhaltung zellulären Integrität, Bewertung von Zellstrukturen wie Spindel Mikrotubuli, Zentrosomen, die Kernhülle und Telomere Anlagen zu verhindern. Live imaging und langfristigen Kultivierung Techniken haben unser Verständnis der weibliche Meiose stark fortgeschritten; ähnliche Konzepte für die gesamte intakten Zelle zu visualisieren sind jedoch weniger häufig für die Untersuchung der Spermatogenese6,7implementiert. Um dynamische Ereignisse in der gesamten männlichen Meiose zu visualisieren, haben wir etablierte Röhrchen Squash Techniken um schnell beurteilen die zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten8,9angepasst. Die hier beschriebene Methode bewahrt die Integrität der Zelle ermöglicht die Untersuchung von mehreren Zellstrukturen während der verschiedenen Phasen der Spermatogenese.
Diese Röhrchen-Squash-Technik ist eine ganze Zelle Ansatz, der für die Beurteilung der Zellstrukturen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht. Gemeinsamen histologischen Ansätze zur meiotic Progression bei männlichen Mäusen wie Hämatoxylin und Eosin Färbung von Paraffin eingebettet Hoden und immunofluorescent Kennzeichnung von Cryosections visualisieren ermöglichen einen umfassenden Überblick über die meiotische fortschreiten. Aber nicht diese Techniken, Einzelzellen, soweit dies zur detaillierten Analyse der Ereignisse in der gesamten Meiose10,11zu lösen. Alternative Techniken meiotische Prozesse visualisieren beruhen auf bedeutende chemiosmotischen Unterbrechung der Spermatocyte zu isolieren und beheben von nuklearem Material3,4,5. Diese chemischen Behandlungen behindern die Beobachtung der Zelltypen als primären Spermatozyten. Eine kürzlich beschriebene Methode durch Namekawa ermöglichte die Forschungsgemeinschaft, die nukleare Architektur des isolierten Spermatozyten zu bewahren, aber erfordert den Einsatz von einem Cytospin und Accessoires, die möglicherweise nicht ohne weiteres zur Verfügung stehen einige Labors4. Im Gegensatz dazu erfordert die Röhrchen Squash Technik nur Geräte, die in der Regel standard in den meisten Zelle Biologie Labors.
Die hier beschriebene Röhrchen Squash-Methode lässt sich die unterschiedlichen Zelltypen gefunden innerhalb der seminiferous Röhrchen, einschließlich Sertoli-Zellen, Spermatogonien, primäre und sekundäre Spermatozyten und Spermatids visualisieren. Durch die Kopplung dieser Technik mit der in der Nähe von synchronen erste Welle der Spermatogenese bei jungen Mäusen, ist es möglich, angereicherte Populationen von spermatogenic Zellen zu erhalten, wie sie durch Meiose12 Fortschritte. Dieses Verfahren ermöglicht die detaillierte Analyse der Prozesse innerhalb der gesamten Spermatogenese, wie frühe Prophase Ereignisse, die G2/MI und Metaphase Anaphase Übergänge und Spermiogenesis. Darüber hinaus können Röhrchen Squash Vorbereitungen zur zytologischen Merkmale der Chromosomen (z. B. interchromatid Domains (ICD) und Kinetochore) und Zentrosomen (Centriolen und Pericentriolar Material/Matrizen) zu visualisieren. Die Squash-Methode kann ohne weiteres parallel andere experimentelle Ansätze, wie z.B. Chromatin Spreads und Proteingewinnung durchgeführt werden. Darüber hinaus wurde diese Technik erfolgreich geändert spermatogenic Frischzellen auf Folien für direkte Visualisierung13zu hinterlegen.
Die hier beschriebene Methode beinhaltet eine ganze Zelle seminiferous Röhrchen Squash Technik um den G2/MI Übergang in Wildtyp C57BL/6J Mäuse zu analysieren. Die zytologischen Merkmale des primären Spermatozyten betreten die erste meiotische Teilung wurden mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie, beobachten die meiotische Spindel visualisiert. Dieses vielseitige Technik kann leicht geändert werden, um andere meiotische Stufen und verschiedene Zelltypen zu visualisieren. Die Technik ist auch offen für alternative Visualisierung Strategien, wie DNA und RNA Fisch Ansätze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mäuse haben sich als nützliche Modellorganismus für die zelluläre Ereignisse, die meiotische Fortschreiten in der Spermatogenese regieren zu studieren. Weiter, es ist notwendig, kümmerten sich um die Untersuchung der Spermatogenese, weil viele Veranstaltungen, wie z. B. Ausstieg aus meiotischen Prophase ich Werkzeuge zu entwickeln, sind sexuell dimorphen. Dieses Protokoll beschreibt eine seminiferous Röhrchen Squash Methode zur Visualisierung und Studium der verschiedenen Phasen der Maus Spermatogenese. Diese Metho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIGMS (R01GM11755), P.W.J und ein Training Stipendium Stipendium vom National Cancer Institute (NIH) (CA009110), S.R.W. und j.h.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
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