माउस मॉडल का उपयोग शुक्राणुजनन के कोशिकाविज्ञान विश्लेषण के लिए एक सेमिनीफेरस Tubule स्क्वैश तकनीक
Summary
इस tubule स्क्वैश तकनीक का लक्ष्य सेलुलर अखंडता के संरक्षण करते हुए माउस spermatocytes के विकास की कोशिकाविज्ञान सुविधाओं का तेजी से आकलन करना है । इस विधि शुक्राणुजनन के सभी चरणों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, और आसानी से माउस अर्धसूत्रीविभाजन के अध्ययन के लिए अंय जैव रासायनिक और आणविक जैविक दृष्टिकोण के साथ कार्यांवित किया जा सकता है ।
Abstract
पुरुषों में Meiotic प्रगति एक प्रक्रिया है कि अत्यधिक विनियमित सेलुलर घटनाओं की एक संख्या के ठोस कार्रवाई की आवश्यकता है । अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान होने वाली त्रुटियों बांझपन, गर्भावस्था के नुकसान या आनुवंशिक दोषों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यौवन की शुरुआत में शुरू और वयस्कता भर में जारी, सतत अर्द्ध spermatocytes की तुल्यकालिक तरंगों शुक्राणुजनन से गुजरना और अंततः अगुणित शुक्राणु फार्म । माउस की पहली लहर spermatocytes दौर से गुजर meiotic दीक्षा दिन में प्रकट 10 के बाद प्रसवोत्तर (10 डीपीपी) और ३५ नलिकाओं में परिपक्व शुक्राणु के रूप में सेमिनीफेरस डीपीपी के लुमेन में जारी कर रहे हैं । इसलिए, यह इस विकास के समय के भीतर चूहों का उपयोग करने के लिए लाभप्रद है-खिड़की के लिए ब्याज की अत्यधिक समृद्ध आबादी को प्राप्त करने के लिए । दुर्लभ कोशिका चरणों का विश्लेषण परवर्ती spermatogenic तरंगों के योगदान के कारण पुराने चूहों में अधिक कठिन है, जो नलिकाओं के भीतर सेलुलर आबादी की विविधता को बढ़ाते हैं । यहां वर्णित विधि चूहों के सेमिनीफेरस नलिकाओं के भीतर पाई जाने वाली कोशिकाओं के कोशिकाविज्ञान मूल्यांकन के लिए एक आसानी से कार्यान्वित तकनीक है, जिसमें spermatogonia, spermatocytes, और spermatids शामिल हैं. tubule स्क्वैश तकनीक अलग नर रोगाणु कोशिकाओं की अखंडता का कहना है और सेलुलर संरचनाओं कि आसानी से अंय तकनीकों के साथ visualized नहीं कर रहे है की परीक्षा की अनुमति देता है । इस tubule स्क्वैश तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करने के लिए, धुरी विधानसभा spermatocytes में निगरानी के लिए चरण के माध्यम से प्रगति कर रहा था metaphase मैं संक्रमण (G2/ इसके अलावा, centrosome दोहराव, meiotic सेक्स गुणसूत्र निष्क्रियता (एमएससीआई), और गुणसूत्र गुलदस्ता गठन कोशिकाविज्ञान संरचनाओं कि इस tubule स्क्वैश विधि का उपयोग कर मनाया जा सकता है के उदाहरण के रूप में मूल्यांकन किया गया । इस तकनीक शुक्राणुजनन कि उत्परिवर्तन या exogenous गड़बड़ी की वजह से कर रहे है के दौरान विशिष्ट दोषों तुच्छ इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस प्रकार, शुक्राणुजनन के हमारे आणविक समझ में योगदान देता है ।
Introduction
अर्धसूत्रीविभाजन एक जटिल सेलुलर घटना है जिसमें डीएनए प्रतिकृति के एक दौर सेल विभाजन के दो क्रमिक दौर के बाद है । सटीक गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करने के लिए अर्धसूत्रीविभाजन के प्रारंभिक चरणों के दौरान कई अर्धसूत्रीविभाजन-विशिष्ट घटनाओं समंवित किया जाना चाहिए । इन घटनाओं में शामिल है मुताबिक़ पुनर्संयोजन के पूरा होने, सह पहली meiotic विभाजन के दौरान बहन kinetochores के उंमुखीकरण, और cohesin परिसरों के stepwise नुकसान chiasmata के बीच homologs को हल करने के लिए । इन प्रक्रियाओं की सटीक विनियमन प्रजनन क्षमता बनाए रखने और गुणसूत्र अलगाव की घटनाओं है कि आनुवंशिक विकासात्मक विकारों और सहज गर्भपात1के लिए नेतृत्व कर सकते है को रोकने के लिए आवश्यक है ।
जबकि अर्धसूत्रीविभाजन की प्रमुख घटनाओं दोनों पुरुषों और महिलाओं में जगह ले, महत्वपूर्ण लौकिक और यंत्रवत मतभेद शुक्राणुजनन और oogenesis2के बीच मौजूद हैं । उदाहरण के लिए, महिला अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, मैं भ्रूण विकास और dictyate चरण में गिरफ्तारियों यौवन तक के दौरान होता है । इसके विपरीत, शुक्राणुजनन यौवन पर शुरू और गिरफ्तारी के बिना वयस्क जीवन भर में लहरों में प्रगति । पुरुष और महिला अर्धसूत्रीविभाजन के बीच मतभेदों को spermatocytes और अंडाणुओं दोनों में इन प्रक्रियाओं का आकलन करने की दिशा में विशेष रूप से पूरा कर रहे है कि तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता पर जोर देती है । वर्तमान में, meiotic प्रगति का आकलन मोटे तौर पर क्रोमेटिन के उपयोग पर निर्भर करता है3,4,5फैलता है । जबकि क्रोमेटिन फैलता meiotic गुणसूत्रों के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं, वे सेलुलर अखंडता को बनाए रखने में विफल, धुरी microtubules, centrosomes, परमाणु लिफाफा, और telomere संलग्नक जैसे सेलुलर संरचनाओं के मूल्यांकन को रोकने. लाइव इमेजिंग और दीर्घकालिक संवर्धन तकनीक ने महिला अर्धसूत्रीविभाजन की हमारी समझ को बहुत उन्नत किया है; इसी तरह पूरे बरकरार सेल कल्पना करने के लिए दृष्टिकोण, तथापि, कम बार शुक्राणुजनन6,7के अध्ययन के लिए लागू किया जाता है । आदेश में पुरुष अर्धसूत्रीविभाजन भर में गतिशील घटनाओं कल्पना करने के लिए, हम tubule स्क्वैश तकनीक की स्थापना के लिए तेजी से विकसित माउस spermatocytes8,9के कोशिकाविज्ञान सुविधाओं का आकलन अनुकूलित किया है । विधि यहां वर्णित कोशिका की अखंडता को बनाए रखता है, शुक्राणुजनन के विभिंन चरणों के दौरान कई सेलुलर संरचनाओं के अध्ययन को सक्षम करने से ।
यह tubule स्क्वैश तकनीक एक पूरी सेल दृष्टिकोण है, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के जरिए सेलुलर संरचनाओं के आकलन के लिए अनुमति देता है । आम ऊतकीय जैसे पुरुष चूहों में meiotic प्रगति कल्पना करने के लिए दृष्टिकोण haematoxylin और आयल एंबेडेड परीक्षण के धुंधला eosin, और immunofluorescent के cryosections लेबलिंग meiotic प्रगति का एक व्यापक सिंहावलोकन के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, इन तकनीकों अर्धसूत्रीविभाजन10,11भर में होने वाली घटनाओं का विस्तृत विश्लेषण के लिए आवश्यक सीमा तक एकल कक्षों को हल करने में विफल । वैकल्पिक तकनीक meiotic प्रक्रियाओं कल्पना करने के लिए spermatocyte को अलग और ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण chemiosmotic व्यवधान पर निर्भर परमाणु सामग्री3,4,5। इन रासायनिक उपचार प्राथमिक spermatocytes के अलावा अंय प्रकार के कक्ष के प्रेक्षण में बाधा । Namekawa द्वारा हाल ही में वर्णित विधि अनुसंधान समुदाय अलग spermatocytes के परमाणु वास्तुकला को बनाए रखने के लिए सक्षम है, लेकिन एक cytospin और सामान है कि कुछ प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है के उपयोग की आवश्यकता है4। इसके विपरीत, tubule स्क्वैश तकनीक केवल उपकरण है कि आम तौर पर सबसे सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में मानक है की आवश्यकता है ।
tubule स्क्वैश विधि यहां वर्णित विविध कोशिका सेमिनीफेरस tubule के भीतर पाया प्रकार, sertoli कोशिकाओं, spermatogonia, प्राथमिक और माध्यमिक spermatocytes, और spermatids सहित कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पास के साथ इस तकनीक युग्मन द्वारा किशोर चूहों में शुक्राणुजनन के तुल्यकालिक पहली लहर, यह spermatogenic कोशिकाओं के समृद्ध आबादी को प्राप्त करने के रूप में वे अर्धसूत्रीविभाजन12के माध्यम से प्रगति संभव है । इस प्रक्रिया में प्रक्रियाओं के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है शुक्राणुजनन, जैसे जल्दी चरण ईवेंट्स, G2/MI और metaphase anaphase संक्रमण के लिए, और spermiogenesis । इसके अलावा, tubule स्क्वैश तैयारी गुणसूत्रों (जैसे interchromatid डोमेन (आईसीडीएस) और kinetochores) की कोशिकाविज्ञान सुविधाओं की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और centrosomes (centrioles और pericentriolar सामग्री/ स्क्वैश विधि आसानी से ऐसे क्रोमेटिन फैलता है और प्रोटीन निष्कर्षण के रूप में अंय प्रयोगात्मक दृष्टिकोण, के साथ समानांतर में प्रदर्शन किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, प्रत्यक्ष दृश्य13के लिए स्लाइड् स पर spermatogenic कक्षों को जमा करने के लिए इस तकनीक को सफलतापूर्वक संशोधित किया गया है ।
विधि यहां वर्णित एक पूरे सेल सेमिनीफेरस tubule स्क्वैश तकनीक शामिल करने के लिए जंगली-प्रकार C57BL/6J चूहों में G2/ प्राथमिक spermatocytes के पहले meiotic विभाजन में प्रवेश के कोशिकाविज्ञान सुविधाओं इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ meiotic धुरी का पालन करने के लिए visualized थे । इस बहुमुखी तकनीक को आसानी से अंय meiotic चरणों और विभिंन प्रकार के सेल कल्पना संशोधित किया जा सकता है । तकनीक भी ऐसे डीएनए और आरएनए मछली दृष्टिकोण के रूप में वैकल्पिक दृश्य रणनीतियों, के लिए उत्तरदायी है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूहों सेलुलर घटनाओं है कि शुक्राणुजनन के दौरान meiotic प्रगति शासन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव साबित किया है । इसके अलावा, यह शुक्राणुजनन के अध्ययन के लिए पूरा उपकरण विकसित करने के लिए आवश्यक ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIGMS (R01GM11755) द्वारा P.W.J. को और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NIH) (CA009110) से S.R.W. और J.H. को एक प्रशिक्षण अनुदान फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
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