Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술
Summary
이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.
Abstract
남성에서 meiotic 진행 높은 규제 셀룰러 이벤트 수의 공동된 작업을 필요로 하는 프로세스입니다. 감수 분열 중 발생 하는 오류는 불 임, 임신 손실 또는 유전자 결함이 발생할 수 있습니다. 사춘기와 성인 기 통해 계속의 개시에 개시, spermatocytes의 연속 반동기 파도 spermatogenesis 받아야 하 고 궁극적으로 단일 정자를 형성 한다. 마우스 spermatocytes meiotic 개시 진행의 첫 번째 파도 (10 dpp) 산 10 일 후에 나타납니다 하 고 35 dpp에서 성숙한 정자로 seminiferous tubules의 루멘으로 해제 됩니다. 따라서, 그것은 관심의 매우 풍부한 인구를 얻기 위하여이 발달 시간 창 내에서 마우스를 이용 하입니다. 희귀 세포 단계의 분석 이전 마우스는 tubules 내 세포 인구의 다양성을 증가 하는 연속 spermatogenic 파도의 기여 금 때문에 더 어렵습니다. 여기 설명 하는 방법을 spermatogonia, spermatocytes, 및 spermatids를 포함 하 여 쥐의 seminiferous tubules 내 세포의 cytological 평가 위한 쉽게 구현 된 기술입니다. 관 스쿼시 기술 격리 된 남성 생식 세포의 무결성을 유지 하 고 세포 구조를 다른 기술로 쉽게 시각화 하지의 시험 있습니다. 설명 하기 위해이 관 스쿼시 기술의 가능한 애플 리 케이 션, 스핀 들 어셈블리 spermatocytes 내가 전환 분열에 의향을 통해 진행 (g 2/미 전환) 모니터링 했다. 또한, centrosome 중복, meiotic 섹스 염색체 비활성화 (MSCI), 및 염색체 꽃다발 형성이 관 스쿼시 메서드를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 cytological 구조의 사례로 평가 됐다. 이 기술은 spermatogenesis 동안 돌연변이 또는 외 인 섭 동에 의해 발생 하는 특정 결함을 정확 하 게 사용할 수 있습니다 따라서, 우리의 분자 spermatogenesis 이해에 기여.
Introduction
감수 분열은 DNA 복제의 단일 라운드 세포 분열의 2 연속 라운드 뒤 복잡 한 세포 이벤트입니다. 여러 감수 분열-특정 이벤트는 정확한 염색체 분리 되도록 감수 분열의 초기 단계에서 조정 해야 합니다. 이러한 이벤트 등 동종 재결합, 자매의 공동 방향의 완료 첫번째 meiotic 사단 그리고 homologs 사이 chiasmata 해결 하려면 cohesin 복합물의 stepwise 손실 동안 kinetochores. 이러한 프로세스의 정확한 규정은 비 옥도 유지 하 고 유전 발달 장애 및 자연 유산1발생할 수 있습니다 염색체 missegregation 이벤트를 방지 하기 위해 필요 합니다.
감수 분열의 주요 이벤트는 남성과 여성 모두에서 자리를 차지할 하는 동안 중요 한 시간적 및 기계적 차이 spermatogenesis 및 oogenesis2사이 존재 한다. 예를 들어 여성 감수 분열, 의향 배아 개발 하는 동안 발생 하 고 dictyate 단계에서 사춘기까지 체포 중 반면, spermatogenesis 사춘기와 체포 하지 않고 성인 생활 내내 파도에 진행 개시. 남성과 여성의 감수 분열의 차이 특히 spermatocytes에 oocytes 이러한 프로세스 평가 쪽으로 음식을 장만 하는 방법을 개발 하는 필요를 강조 한다. 현재, chromatin 스프레드3,,45의 사용에 의존 meiotic 진행을 주로 평가 합니다. Chromatin 스프레드 meiotic 염색체를 공부 하는 데 유용 동안, 그들은 세포 구조 스핀 들 microtubules, centrosomes, 핵 봉투, telomere 첨부 파일 등의 평가 방지 하는 세포 무결성을 유지 하 실패. 라이브 이미징 및 장기 자란 기술을 크게 고급 여성 감수 분열;에 대 한 우리의 이해 그러나 전체 그대로 셀 시각화를 유사한 방법, 자주 spermatogenesis6,7의 연구에 대 한 구현 됩니다. 남성 감수 분열을 통해 동적 이벤트를 시각화 하기 위해 우리 빠르게 마우스 spermatocytes8,9개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해 설립 된 관 스쿼시 기술을 적응 시켰다. 여기 설명 하는 방법을 spermatogenesis의 다른 단계 동안 여러 세포 구조의 연구를 활성화 하는 세포의 무결성을 유지 합니다.
이 관 스쿼시 기술은 면역 형광 현미경을 통해 세포 구조의 평가 대 한 허용 하는 전체 셀 접근 이다. Haematoxylin 오신 파라핀 포함 testes, 및 cryosections의 immunofluorescent 라벨의 얼룩 등 남성 쥐에서 meiotic 진행을 시각화 하기 위해 일반적인 조직학 접근 허용 meiotic 진행에 대 한 광범위 한 개요. 그러나, 이러한 기술을 감수 분열10,11에 걸쳐 발생 하는 이벤트의 자세한 분석을 위해 필요한 범위 내에 단일 셀을 해결 하기 위해 실패 합니다. 대체 기술을 meiotic 프로세스를 시각화 하는 격리 하 고 수정 핵 자료3,,45spermatocyte 중요 한 chemiosmotic 중단에 의존 합니다. 이러한 화학 치료 기본 spermatocytes 다른 세포 유형의 관찰을 방해. Namekawa에 의해 최근에 설명된 방법 격리 spermatocytes의 핵 건축을 보존 하기 위해 연구 커뮤니티 활성화 하지만 cytospin 및 일부 실험실4쉽게 사용할 수 없을 수 있는 액세서리를 사용 해야 합니다. 대조적으로, 관 스쿼시 기술에는 대부분 세포 생물학 실험실에서 일반적으로 표준 장비를 필요 합니다.
여기 설명 하는 관 스쿼시 방법은 시각화 sertoli 세포, 등 spermatogonia, 기본 및 보조 spermatocytes spermatids seminiferous 관 내의 다양 한 셀 형식에 사용할 수 있습니다. 여 청소년 쥐에서 spermatogenesis 근처 동기 첫 번째 물결에이 기술을 결합해, 그들은 감수 분열12진행 spermatogenic 세포의 풍부한 인구를 가능 하다. 이 프로세스는 spermatogenesis 초기 의향 이벤트 등을 통해 프로세스의 상세한 분석, g 2/미와 분열 anaphase 전환 및 spermiogenesis를 허용합니다. 또한, 관 스쿼시 준비 시각화 염색체 (예: interchromatid 도메인 (Icd) 및 kinetochores)와 centrosomes (centrioles 및 pericentriolar 재료/행렬)의 cytological 기능을 사용할 수 있습니다. 스쿼시 메서드 chromatin 확산과 단백질 추출 등 다른 실험 방법 동시에 손쉽게 수행할 수 있습니다. 또한,이 기술은 성공적으로 수정 되었습니다 직접 시각화13슬라이드에 생활 spermatogenic 셀을 입금.
여기 설명 하는 방법을 야생-타입 C57BL/6J 마우스에서 g 2/미 전환 분석 전체 셀 seminiferous 관 스쿼시 기술을 포함 한다. 첫 번째 meiotic 부문 입력 기본 spermatocytes의 cytological 기능 관찰 meiotic 스핀 들에 면역 형광 검사 현미경 검사 법으로 시각화 했다. 이 다재 다능 한 기술은 다른 meiotic 단계와 다른 세포 유형 시각화를 쉽게 수정할 수 있습니다. 기술은 의무가 DNA와 RNA 물고기 접근 등 대체 시각화 전략 이기도합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스는 셀룰러 이벤트 spermatogenesis 동안 meiotic 진행을 제어 하는 공부에 대 한 유용한 모델 유기 체 입증. 또한, 그것 때문에 많은 이벤트와 같은 종료 meiotic 의향에서 내가 spermatogenesis의 연구 들만 하는 도구를 개발 하는 데 필요한, 성적으로 동종이 형. 이 프로토콜 seminiferous 관 스쿼시 방법을 시각화 및 서로 다른 단계의 마우스 spermatogenesis의 연구에 설명합니다. 이 방법은 세포 무결성을 보존 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 NIGMS (R01GM11755) P.W.J.에 의해 및 훈련 그랜트 친목에서 미국 국립 암 연구소 (NIH) (CA009110) S.R.W. 하 재 혁에 의해 지원 되었다
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?. Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
