En Seminiferous Tubule Squash teknikk for fargemaskin analyse av Spermatogenesis ved hjelp av musen-modellen
Summary
Målet med denne tubule squash teknikken er å raskt vurdere fargemaskin funksjoner for å utvikle musen spermatocytes samtidig som du beholder mobilnettet integritet. Denne metoden muliggjør studiet av alle faser av spermatogenesis, og kan enkelt implementeres sammen med andre biokjemiske og molekylære biologiske metoder for studier av musen meiose.
Abstract
Meiotic progresjon hos menn er en prosess som krever felles handlingen av en rekke sterkt regulerte mobilnettet hendelser. Feil som oppstod under meiose kan føre til sterilitet, graviditet eller genetiske defekter. Begynner ved utbruddet av puberteten og fortsetter gjennom voksen alder, kontinuerlig halvsynkron bølger av spermatocytes gjennomgå spermatogenesis og til slutt danne haploid sperm. Den første bølgen av musen spermatocytes gjennomgår meiotic innvielsen vises på dag 10 post-partum (10 dpp) og slippes lumen av seminiferous tubules som modne sædceller på 35 dpp. Derfor er det en fordel å bruke mus i denne utviklingsmessige-vinduet for å få høyanriket bestander av interesse. Analyse av sjeldne celle stadier er vanskeligere i eldre mus på grunn av bidrag av påfølgende spermatogenic bølger, som øke mangfoldet av mobilnettet befolkningen i på tubuli. Metoden beskrevet her er en lett implementert teknikk for fargemaskin vurdering av cellene innen de seminiferous tubules mus, inkludert spermatogonia, spermatocytes og spermatids. Tubule squash teknikken opprettholder integriteten til isolerte mannlige bakterie celler og tillater undersøkelse av cellulære strukturer som ikke er lett å visualisere med andre teknikker. For å demonstrere de mulige anvendelser av denne tubule squash teknikken, ble spindelen montering kartlagt i spermatocytes komme videre gjennom prophase til metaphase jeg overgang (G2/MI overgang). I tillegg ble centrosome duplisering, meiotic sex-kromosom inaktivering (MSCI) og kromosom bukett formasjon vurdert som eksempler på fargemaskin strukturer som kan observeres med denne tubule squash metoden. Denne teknikken kan brukes til å finne bestemte feil under spermatogenesis forårsaket av mutasjoner eller eksogene forstyrrelsene, og dermed bidrar til våre molekylære forståelse av spermatogenesis.
Introduction
Meiose er en kompleks mobilnettet hendelse som én enkelt runde med utryddelse er fulgt av to påfølgende rundene av cellen divisjon. Flere meiose-spesifikke hendelser koordineres under den innledende stadiet av meiose å sikre nøyaktige kromosom raseskille. Disse hendelsene inkluderer ferdigstillelse av homologe rekombinasjon, co retningen på søster kinetochores under den første meiotic divisjonen, og gradvis tap av cohesin komplekser løse chiasmata mellom homologs. Presis regulering av disse prosessene er å opprettholde fruktbarhet og hindre kromosom missegregation hendelser som kan føre til genetisk utviklingsforstyrrelser og spontan abort1.
Mens de viktigste hendelsene i meiose finne sted i både hanner og hunner, forskjeller betydelig timelige og mekanistisk mellom spermatogenesis og oogenesis2. For eksempel under kvinnelige meiose, prophase jeg oppstår under embryonale utviklingen og arrestasjoner på dictyate scenen før puberteten. Derimot starter spermatogenesis på puberteten og utvikler seg i bølger over hele voksenlivet uten arrestasjon. Forskjellene mellom mannlige og kvinnelige meiose understreker behovet for å utvikle metoder som er spesielt rettet mot vurdere disse prosessene i både spermatocytes og oocytes. Foreløpig avhengig vurdering meiotic progresjon i stor grad av bruk av chromatin sprer3,4,5. Mens chromatin oppslag er nyttig for å studere meiotic kromosomer, mislykkes de å bevare mobilnettet integritet, hindrer evaluering av cellulære strukturer som spindel piskehale som henger, centrosomes, kjernefysiske konvolutten og telomere vedlegg. Live bildebehandling og langsiktig dyrking teknikker har sterkt avansert vår forståelse av kvinnelige meiose; lignende tilnærminger til å visualisere hele intakt cellen, men implementeres sjeldnere for studier av spermatogenesis6,7. For å visualisere dynamisk arrangementer gjennom hele mannlige meiose, har vi tilpasset etablerte tubule squash teknikker for å raskt vurdere fargemaskin funksjonene for å utvikle musen spermatocytes8,9. Metoden beskrevet her opprettholder integriteten til cellen, muliggjør studiet av flere cellulære strukturer under ulike stadier av spermatogenesis.
Denne tubule squash teknikken er en hele cellen tilnærming, som tillater for vurdering av cellulære strukturer via immunofluorescence mikroskopi. Felles histologiske tilnærminger til å visualisere meiotic progresjon i mannlige mus som haematoxylin og eosin flekker av parafin innebygd testiklene, og immunofluorescent merking av cryosections gir en bred oversikt over meiotic progresjon. Men disse teknikkene ikke løse enkeltceller grad for detaljert analyse av hendelser oppstår gjennom meiose10,11. Alternative teknikker for å visualisere meiotic prosesser er avhengige av betydelig chemiosmotic avbrudd i spermatocyte å isolere og løse kjernefysisk materiale3,4,5. Disse kjemiske behandlinger hindre observasjon av celletyper enn primære spermatocytes. En nylig beskrevet metoden av Namekawa har aktivert forskningen fellesskapet å bevare kjernefysiske arkitektur isolert spermatocytes, men krever bruk av en cytospin og tilbehør som ikke kan være lett tilgjengelig for noen laboratorier4. Tubule squash teknikken krever derimot bare utstyr som er vanligvis standard i de fleste celle biologi laboratorier.
Tubule squash metoden beskrevet her kan brukes å visualisere de ulike celletyper innen den seminiferous tubule, inkludert sertoli celler, spermatogonia, primære og sekundære spermatocytes og spermatids. Ved å koble denne teknikken med nær-synkron første bølgen av spermatogenesis i juvenile mus, er det mulig å få beriket bestander av spermatogenic celler som de fremskritt gjennom meiose12. Denne prosessen tillater den detaljerte analysen av prosessene i spermatogenesis, for eksempel tidlig prophase hendelser, G2/MI og metaphase anaphase overganger, og spermiogenesis. Videre kan tubule squash preparater brukes å visualisere fargemaskin funksjoner av kromosomer (interchromatid domener (ICDs) og kinetochores) og centrosomes (centrioles og pericentriolar materiale/matriser). Metoden squash kan lett utføres parallelt med andre eksperimentelle tilnærminger, som chromatin oppslag og protein utvinning. Dessuten, er denne teknikken ble endret for å sette inn levende spermatogenic celler på lysbilder for direkte visualisering13.
Metoden beskrevet her innebærer en hele cellen seminiferous tubule squash teknikk for å analysere G2/MI overgangen i vill-type C57BL/6J mus. Fargemaskin funksjonene i primære spermatocytes inn første meiotic divisjon ble visualisert med immunofluorescence mikroskopi å observere meiotic spindelen. Denne allsidige teknikken kan enkelt endres for å se andre meiotic stadier og forskjellige celletyper. Teknikken er også mottakelig for alternative visualisering strategier, som DNA og RNA fisk tilnærminger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mus har vist seg for å være en nyttig modell organisme for å studere mobilnettet hendelsene som styrer meiotic progresjon i spermatogenesis. Videre, det er nødvendig å utvikle verktøy rettet til studiet av spermatogenesis fordi mange arrangementer, som ut fra meiotic prophase jeg, er dekket av hvit. Denne protokollen beskriver seminiferous tubule squash metode for visualisering og studie av ulike stadier av musen spermatogenesis. Denne metoden beholder mobilnettet integritet, og gir dermed detaljerte analyser av kj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIGMS (R01GM11755) til P.W.J. og en trening grant fellowship fra National Cancer Institute (NIH) (CA009110) S.R.W. og J.H.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?. Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
