En seminifera tubuli Squash teknik för Cytologisk analys av spermatogenesen använder musmodell
Summary
Målet med denna tubuli squash teknik är att snabbt bedöma cytologiska funktioner att utveckla mus spermatocyter samtidigt bevara cellulär integritet. Denna metod möjliggör studiet av alla stadier av spermatogenesen, och lätt kan genomföras parallellt med andra biokemiska och molekylära biologiska metoder för studier av mus meios.
Abstract
Meiotiska progression hos hanar är en process som kräver den samordnade åtgärden ett antal reglerade cellulära händelser. Fel som uppstår under meios kan leda till infertilitet, missfall eller genetiska defekter. Påbörjas i början av puberteten och fortsätter under hela vuxenlivet, kontinuerlig semi-synkron vågor av spermatocyter genomgå spermatogenes och slutligen bilda haploida spermier. Den första vågen av mus spermatocyter genomgår meiotiska initiering visas på dag 10 efter förlossningen (10 dpp) och släpps ut i lumen av sädeskanalerna som mogna spermier på 35 dpp. Därför är det fördelaktigt att utnyttja möss inom detta utvecklingsmässiga tidsfönster för att få höganrikat populationer av intresse. Analys av ovanlig cell stadier är svårare i äldre möss på grund av bidraget av spermatogenesisk omgångar, som ökar mångfalden av de cellulära populationerna inom tubuli. Den metod som beskrivs här är en enkelt genomförd teknik för Cytologisk bedömning av de celler som finns inom sädeskanalerna av möss, inklusive spermatogonier, spermatocyter och spermatids. Tubuli squash tekniken upprätthåller integriteten för isolerade manliga könsceller och tillåter granskning av cellulära strukturer som inte visualiseras enkelt med andra tekniker. För att visa de möjliga tillämpningarna av denna tubuli squash teknik, övervakades spindelenhet i spermatocyter fortskrider genom profas till metafas jag övergång (G2/MI övergång). Dessutom bedömdes centrosome duplicering, meiotiska könskromosom inaktivering (MSCI) och kromosom bukett bildandet som exempel på den cytologiska strukturer som kan observeras här tubuli squash metoden. Denna teknik kan användas för att peka ut specifika defekter under spermatogenes som orsakas av mutation eller EXOGEN störning, och således bidrar till vår molekylär förståelse av spermatogenes.
Introduction
Meios är en komplex cellulära händelse där en enda runda för DNA-replikation följs av två på varandra följande rundorna av celldelning. Flera meios-specifika händelser måste samordnas under de inledande skedena av meios att säkerställa korrekt kromosomsegregering. Dessa händelser inkluderar slutförandet av homolog rekombination, samtidig läggning av syster kinetochores under den första meiotiska divisionen, och stegvis förlusten av cohesin komplex att lösa chiasmata mellan homologs. Exakt reglering av dessa processer är nödvändigt att bibehålla fertiliteten och förhindra kromosom missegregation händelser som kan leda till genetisk utvecklingsstörningar och spontana missfall1.
Medan de viktiga händelserna i meiosen sker hos både män och kvinnor, finns betydande temporal och mekanistiska skillnader mellan spermatogenes och oogenes2. Till exempel under kvinnliga meios, profas jag uppstår under fosterutvecklingen och gripanden i dictyate skede fram till puberteten. Däremot börjar spermatogenes vid puberteten och fortskrider i vågor under hela vuxenlivet utan gripandet. Skillnaderna mellan manliga och kvinnliga meios betonar behovet av att utveckla metoder som tillgodoses specifikt mot bedömningen av dessa processer i både spermatocyter och oocyter. För närvarande beroende bedömer meiotiska progression till stor del av användning av kromatin sprider3,4,5. Medan kromatin sprider är användbar för att studera meiotiska kromosomer, misslyckas de med att bevara cellulär integritet, förhindra utvärdering av cellulära strukturer såsom spindeln mikrotubuli, centrosomes, kärn kuvert och telomer bilagor. Live imaging och långsiktig odling tekniker har mycket avancerade vår förståelse av kvinnliga meios; liknande metoder för att visualisera hela intakta cellen, genomförs dock mindre ofta för studiet av spermatogenesen6,7. För att visualisera dynamiska händelser under hela manliga meios, har vi anpassat etablerade tubuli squash tekniker för att snabbt bedöma de cytologiska funktionerna att utveckla mus spermatocyter8,9. Den metod som beskrivs här upprätthåller integriteten av cellen, möjliggör studier av flera cellulära strukturer under olika skeden av spermatogenes.
Denna tubuli squash teknik är ett hela cellen synsätt, vilket möjliggör bedömning av cellulära strukturer via immunofluorescens mikroskopi. Gemensamma histologiska metoder att visualisera meiotiska progression hos hanmöss som hematoxylin och eosin färgning av paraffin inbäddade testiklar och Immunofluorescerande märkning av kryosnitt möjliggör en bred översikt av meiotiska progression. Dessa tekniker fungerar emellertid inte att lösa enstaka celler i utsträckning som är nödvändig för detaljerad analys av de händelser som inträffar i hela meios10,11. Alternativa tekniker för att visualisera meiotiska processer är beroende av betydande kemiosmotisk störningar för spermatocyte att isolera och åtgärda kärnämnen3,4,5. Dessa kemiska behandlingar hindra observationen av celltyper än primära spermatocyter. En nyligen beskriven metod av Namekawa har gjort det möjligt för forskarsamhället att bevara isolerade spermatocyter nukleära arkitektur, men kräver användning av en cytospin och tillbehör som inte kan vara lätt tillgänglig för vissa laboratorier4. Tubuli squash tekniken kräver däremot endast utrustning som är allmänt standard i de flesta cellbiologi laboratorier.
Tubuli squash metoden som beskrivs här kan användas för att visualisera de olika celltyper som finns inom de seminifera tubuli, inklusive sertoli celler, spermatogonier, primära och sekundära spermatocyter och spermatids. Genom att koppla denna teknik med den nära-synkron första vågen av spermatogenes hos juvenila möss, är det möjligt att få berikade populationer av spermatocyt celler som de framsteg genom meios12. Denna process möjliggör detaljerad analys av processer i hela spermatogenes, såsom tidig profas händelser, G2/MI och metafas Anaphasen övergångar och spermiogenesis. Tubuli squash preparat kan dessutom användas för att visualisera cytologiska funktionerna i kromosomer (t.ex. interchromatid domäner (ICDs) och kinetochores) och centrosomes (centrioles och pericentriolar material/matriser). Metoden squash kan lätt utföras parallellt med andra experimentella metoder, såsom kromatin sprider och protein utvinning. Denna teknik har dessutom ändrats framgångsrikt för att deponera levande spermatocyt celler på bilder för direkt visualisering13.
Den metod som beskrivs här innebär en hel cell seminifera tubuli squash teknik för att analysera G2/MI övergången i vildtyp C57BL/6J möss. Cytologiska funktioner i primära spermatocyter in första meiotiska divisionen var visualiserat med immunofluorescens mikroskopi att iaktta meiotiska spindeln. Denna mångsidiga teknik kan enkelt modifieras för att visualisera andra meiotiska stadier och olika celltyper. Tekniken är också mottagliga för alternativa visualisering strategier, till exempel DNA och RNA fisk strategier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Möss har visat sig vara en användbar modellorganism för att studera de cellulära händelser som styr meiotiska progression under spermatogenes. Ytterligare, det är nödvändigt att utveckla verktyg catered till studiet av spermatogenesen eftersom många evenemang, såsom jag avsluta från meiotiska profas i, är könsdimorfism. Det här protokollet beskriver en seminifera tubuli squash metod för visualisering och studien av olika skeden av mus spermatogenes. Denna metod bevarar cellulär integritet och tillåter d?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var stöds av NIGMS (R01GM11755) till P.W.J. och ett utbildning bevilja stipendium från National Cancer Institute (NIH) (CA009110) till S.R.W. och J.H.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?. Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
