꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

Summary

여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

Abstract

마지막 십 년간에서 Alzheimer의 질병 (광고) 등 파 킨 슨 병 (PD), 신경 장애의 보급은 성장 했다. 이 나이 관련 무질서는이 환자의 두뇌에 있는 fibrillary 구조 단백질의 모양 특징. 일반적으로 수용 성 단백질을 받을 이유는 정확 하 게 집계 프로세스를 제대로 이해 남아 있습니다. 발견 단백질 집계 질병 프로세스에 국한 되지 않습니다 정상적인 노화 과정의 일부 단백질 집계, ectopically를 사용 하지 않고 조절 분자 및 세포 메커니즘의 연구를 활성화 하는 대신 인간의 표현 질병 관련 단백질입니다. 여기는 상호 보완적인 접근 방식을 통해 꼬마 선 충 에서 고유의 단백질 집계를 검토 하는 방법론에 설명 합니다. 첫째, 우리 세 동물을 얻을 나이 동기화 C. 선 충 의 많은 성장 하는 방법을 검토 하 고 우리는 매우 불용 성-큰 집계 분리 하 생 화 확 적인 절차를 제시. 대상된 유전 최저와 함께, 그것은 홍보 또는 양이 많은 질량 분석 어느 포괄적인 분석을 사용 하 여 연령에 따라 단백질 집계 방지에 관심사의 유전자의 역할을 해 부 수 또는 후보-기반 항 체와 분석입니다. 이러한 결과 다음 형광 태그 집계 하기 쉬운 단백질을 표현 하는 유전자 변형 동물 vivo에서 분석에 의해 확인 됩니다. 이러한 메서드는 특정 단백질은 나 이와 함께 집계 및 궁극적으로 완전 한 기능이 단백질을 유지 하는 방법 하는 경향이 이유를 명확히 하는 데 도움이 됩니다.

Introduction

단백질 misfolding 및 집계 AD, PD, 루 경화 증 (ALS), frontotemporal 치 매 (FTD), 그리고 많은 다른 같은 여러 신경 퇴행 성 질환의 특징으로 인식 됩니다. 예를 들어, 녹말 체 소에 α-synuclein 어셈블리는 악화 모터 신경에 있는 양식 세포질 집계에 ALS 환자 TDP-43 또는 FUS misfold에 PD 환자의 substantia nigra에 특히 Lewy 몸으로 축적. 각 이러한 신경 퇴행 성 질환, 단백질 항상성 또는 proteostasis를 유지 하는 메커니즘 질병에 따라서 선도 misfolded 단백질의 축적을 방지 하기 위해 실패 합니다.

Proteostasis 세포 기능을 보장 하기 위해 중요 한 이며, 정상적인 조건 하에서 이러한 규제 메커니즘 단단히 단백질 합성, 접는, 그리고 성능 저하의 속도 제어 합니다. 여러 연구 결과 입증 노화, 수 많은 세포와 장기의 단백질 항상성 유지가 점차적으로 손상 된과 나이 proteostasis 네트워크의 생리 적 저하는에 대 한 중요 한 악화 요인 신경 퇴행 성 질병 (참조^1,2,3검토). 사실 단백질 품질 관리 및 펼친된 단백질 스트레스 세포 응답 나이 손상 단백질 misfolding 및 집계 노화의 일반적인 결과 수 제안 합니다. 사실, 우리와 다른 증명 단백질 집계는 질병을 제한 하 고 대신는 프로테옴의 일부 세 동물^{4,,56,7 세제 불용 성 높게 된다 ,8,,910}. 계산 그리고 vivo에서 분석 이러한 생리 연령 관련 집계 여러 측면⁵질병 집계 닮은 밝혔다. 내 인 성, 연령에 따라 단백질 집단의 발견 우리 ectopically 표현된 인간의 질병 관련 단백질을 사용 하지 않고 단백질 집계, 조절 분자 및 세포 메커니즘을 해 부를 기회를 제공 합니다. 현재, 제한 된 정보만 광범위 한 단백질 용해성의 규칙에 대 한 고 생물의 건강에이 dysregulation의 효과 대 한 존재합니다.

선 충 C. 선 충 이 동물 상대적으로 짧은 수명이 있고 더 높은 유기 체에서 관찰 된 많은 특성 에이징 기능을 표시 조사를 노화에서 가장 광범위 하 게 연구 모형 유기 체 중 하나입니다. 용해성 단백질에 노화의 효과 추출 질병 집계 neurodegeneration 연구^{11의 분야에서 널리 이용 되는 차동 용 해도에 따라 순차 생 화 확 적인 분류에 의해 C. 선 충 에서 연구} . 양이 많은 질량 분석에 의해 몇 백 단백질 집계-경향이 된다 C. 선 충 에 질병⁵의 부재를 보였다. 여기 우리가 자세히 설명 액체 문화와 서쪽 오 점 하 여 질량 분석 및 분석 하 여 정량화에 대 한 집계 된 단백질을 순차 추출에 벌레의 많은 수를 성장 하는 프로토콜. 집계 하기 쉬운 단백질을 misfolded 세에 축적 하기 때문에 다른 체세포 조직^5,,1213에 선 충 C. 생식 선 및 마스크 변경, 우리를 사용 하 여 생식이 돌연변이 단백질 분석 초점 비 생식 조직에 용해성입니다. 제시 하는 방법에는 0.5 %SDS 불용 성 및 상대적으로 낮은 원심 속도 의해 수송과 매우 불용 성, 큰 집계 분석 수 있습니다. 또한 작고 더 녹는 집계 수집 하 덜 엄격한 추출 프로토콜 또는 되었습니다 다른 곳에서¹⁰출판. 또한, 집계에서 vivo에서 C. 선 충에 평가 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.

전반적으로, RNA 간섭 (RNAi)와 함께에서 이러한 메서드는 연령에 따라 단백질 집계 변조에 관심사의 유전자의 역할을 평가할 수 있다. 이 대 한 우리와 RNAi를 사용 하 여 관심사의 특정 단백질의 분해 없이 젊고 세 벌레에서 추출의 분석을 설명 합니다. 이러한 메서드는 단백질 용해성을 조절 하는 proteostasis 네트워크의 구성 요소를 결정 하는 강력한 도구 이어야 한다. 여러 중재와 같은 감소 인슐린/인슐린 같은 성장 인자 (IGF)을 극적으로 선 충 C. 노화¹⁴지연 표시 1 신호 (IIS). 장 수 경로 종종 단백질 품질 관리 메커니즘을 유발 하 고 따라서 이러한 경로 수 적극적으로 영향을 미치는 수 단백질 집단의 속도. 예를 들어, IIS 경로⁷의 억제에 따라 수명이 긴 동물에 감소 고유의 단백질 집합을 설명합니다.

Protocol

참고: 절차의 더 나은 이해에 대 한 워크플로 (그림 1)의 회로도 연결 됩니다. 1. 영의 큰 숫자와 세 C. 선 충 의 성장 대상이 RNAi를 대상으로 관심의 유전자 참고: 사용 C. 선 충 살 균 온도 유도 gon-2(q388) 돌연변이 (CF2253) 큰 세 동기화 인구를. 모든 단계는 화로와 반 메 마른 조건 하에서 작동 하 고 아무 오염 균 류 또?…

Representative Results

우리가 사용 하는 방법 여기 어떻게 수명이 긴 동물을 평가 하 여 감소 IIS 변조 연령에 따라 단백질 집계. 서쪽으로 오 점 (단계를 참조 하십시오 2.2, 빨리 서쪽 오 점 분석에 대 한 불용 성 단백질 추출), 우리는 총 영 (성년의 날 3)의 불용 성 단백질 함량을 분석 (성년의 날 18) 웜 제어 RNAi와 RNAi는 인슐린을 대상으로 세 / IGF-1-같은 수용 체 daf-2. RNAi 조건 (<strong class="xfi…

Discussion

여기 우리는 매우 불용 성 단백질 질량 분석 및 서쪽 blotting에 의해 분석을 위한 RNAi를 받게 되는 선 충 C. 노화에서 집계를 분리 하는 방법을 보고 합니다. 우리는 그 연령에 따라 단백질 집계 방지 proteostasis IIS를 크게 줄임으로써 향상을 보여줍니다. 특정 집계 경향이 단백질 C. 선 충에서 overexpress을 선택 하 여 추가 고유의 단백질 집계를 변조 하는 메커니즘을 해 부 수는.

<p class="j…

Materials

Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1088655	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	09830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4352135	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	393315
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5404000413
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentrator Plus	Eppendorf	5305000304	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158		Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]