Metoder til undersøgelse ændringer i iboende Protein sammenlægning med alder i Caenorhabditis elegans
Summary
Målet med den metode, der præsenteres her er at udforske protein sammenlægning under normal aldring i model organisme C. elegans. Protokollen repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at studere meget tungtopløseligt store aggregater, der danner med alderen og at fastslå, hvordan ændringer i proteostasis påvirker protein sammenlægning.
Abstract
I de sidste årtier, er forekomsten af neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers sygdom (AD) og Parkinsons sygdom (PD), vokset. Disse alder-associerede forstyrrelser er kendetegnet ved forekomsten af protein aggregater med fibrillære struktur i hjernen hos disse patienter. Præcis derfor normalt opløselige proteiner undergår forbliver en sammenlægning proces dårligt forstået. Den opdagelse, at protein sammenlægning er ikke begrænset til sygdomsprocesser og i stedet en del af den normale aldringsproces giver mulighed for undersøgelse af de molekylære og cellulære mekanismer, der regulerer protein sammenlægning, uden at bruge ectopically udtrykt menneskelige sygdom-associerede proteiner. Her beskriver vi metoder til at undersøge iboende protein sammenlægning i Caenorhabditis elegans gennem komplementære metoder. Først skal vi undersøge, hvordan at vokse stort antal alder-synkroniseret C. elegans at få fyldt dyr og præsenterer vi de biokemiske procedurer for at isolere meget-uopløselige-store aggregater. I kombination med en målrettet genetiske knockdown, det er muligt at dissekere et gen af interesse i at fremme eller forebygge aldersbetinget protein sammenlægning ved hjælp af enten en omfattende analyse med kvantitativ massespektrometri rolle eller en kandidat-baseret analyse med antistoffer. Disse resultater bekræftes derefter af i vivo analyse med transgene dyr udtryk for fluorescerende-tagged sammenlægning-tilbøjelige proteiner. Disse metoder bør hjælpe klarlægge hvorfor visse proteiner er udsat for aggregat med alderen og i sidste ende hvordan du holder disse proteiner fuldt funktionel.
Introduction
Protein misfoldning og sammenlægning er anerkendt som et adelsmærke for flere neurodegenerative sygdomme som annonce, PD, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og mange andre. For eksempel, α-synuclein forsamlinger i amyloid fibriller der ophobes som Lewy organer især i substantia nigra PD patienter, mens i ALS patienter TDP-43 eller FUS misfold til form cytoplasmatisk aggregater i udarter motor neuroner. I hver af disse neurodegenerative sygdomme undlader mekanismer opretholde protein homøostase eller proteostasis at forhindre ophobning af fejlfoldede proteiner, derfor fører til sygdom.
Proteostasis er afgørende for at sikre cellulære funktioner og under normale betingelser disse reguleringsmekanismer styre stramt hastigheden af proteinsyntesen, folde og nedbrydning. Flere undersøgelser viser, at med aldrende, mange celler og organer evne til at bevare protein homeostase er gradvist kompromitteret og fysiologiske forværringen af proteostasis netværkene med alder er en vigtig skærpende faktor for neurodegenerative sygdomme (gennemgik i referencer1,2,3). Det faktum, at protein kvalitetskontrol og den cellulære reaktion på udfoldet protein stress er kompromitteret med alderen tyder på, at protein misfoldning og sammenlægning kunne være en almindelig konsekvens af aldring. Ja, vi og andre har demonstreret at protein sammenlægning er ikke begrænset til sygdom og i stedet en del af proteomet bliver meget detergent-uopløselige i alderen dyr4,5,6,7 ,8,9,10. Numerisk og i vivo analyse afslørede, at disse fysiologiske aldersrelaterede aggregater ligne sygdom aggregater i flere aspekter5. Opdagelsen af endogene, aldersbetinget protein aggregation giver os mulighed for at dissekere de molekylære og cellulære mekanismer, der regulerer protein sammenlægning, uden at bruge ectopically udtrykt menneskelige sygdom-associerede proteiner. I øjeblikket findes kun begrænsede oplysninger om regulering af udbredt protein kan og om virkningerne af denne dysregulering på sundheden for organismen.
Den nematodeprøveudtagning C. elegans er en af de mest omfattende studerede modelorganismer i aldring forskning, som disse dyr har en forholdsvis kort levetid og vise mange karakteristiske aging funktioner observeret i højere organismer. Virkningerne af aldring på protein kan er blevet undersøgt i C. elegans af sekventielle biokemiske fraktionering baseret på differentierede opløselighed, som er almindeligt anvendt til at udtrække sygdom aggregater i neurodegeneration forskningsområdet11 . Ved kvantitativ massespektrometri, var flere hundrede proteiner vist at blive sammenlægning-liggende i C. elegans i mangel af sygdom5. Her beskriver vi i detaljer protokollen for at vokse stort antal orme i flydende kultur og den sekventielle udvinding at isolere aggregerede proteiner til kvantificering af massespektrometri og analyse af vestlige skamplet. Fordi fejlfoldede og sammenlægning-tilbøjelige proteiner ophobes i alderen C. elegans gonaderne og masker ændringer i andre somatiske væv5,12,13, bruger vi en gonade-mindre mutant for at fokusere analysen på protein kan i ikke-reproduktive væv. Metoden fremlægges muliggør analysen af stærkt uopløseligt, store aggregater, der er uopløselig i 0,5% SDS og pelleted ved relativt lav centrifugal hastighed. Alternativt, et lempeligere udvinding protokollen at indsamle også mindre og mere opløselige aggregater har været offentliggjort andetsteds10. Derudover beskrive vi metoden bruges til at vurdere sammenlægning i vivo i C. elegans.
Samlet set kan disse metoder i kombination med RNA-interferens (RNAi) vurdere rolle i et gen af interesse i modulerende aldersbetinget protein sammenlægning. Dette beskriver vi analyse af uddrag af unge og ældre orme med og uden knockdown af et specifikt protein af interesse ved hjælp af RNAi. Disse metoder bør være et effektivt redskab til at bestemme, hvilke komponenter af proteostasis netværket regulere protein kan. Flere interventioner såsom nedsat insulin/insulin-lignende vækstfaktor (IGF) 1 signalering (IIS) har vist at dramatisk forsinke C. elegans aging14. Levetiden veje fremkalde ofte protein-kvalitet kontrolmekanismer og dermed disse veje kunne aktivt påvirke hastigheden af protein sammenlægning. Som et eksempel demonstrere vi reduceret iboende protein sammenlægning i langlivede dyr ved hæmning af IIS vej7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her rapporterer vi en metode til at isolere meget uopløseligt protein aggregater fra aging C. elegans udsat for RNAi for analyse af massespektrometri og Western blotting. Vi viser, at forbedre proteostasis ved at reducere IIS høj grad forhindrer aldersbetinget protein sammenlægning. Ved at vælge specifikke sammenlægning-tilbøjelige proteiner til overexpress i C. elegans, er det muligt at dissekere yderligere mekanismer modulerende iboende protein sammenlægning.
<strong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra DZNE og en Marie Curie International reintegrationsstipendium (322120 til D.C.D.)
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
