שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans
Summary
מטרת השיטה המובאת כאן היא לבחון חלבון צבירת במהלך הזדקנות נורמלית בתוך האורגניזם דגם C. elegans. הפרוטוקול מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד מצרפי גדול מאוד מסיסים היוצרים עם הגיל וכדי לקבוע כיצד משפיעים השינויים פרוטוסטאזיס חלבון צבירת.
Abstract
בעשרות השנים האחרונות, השכיחות של הפרעות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), גדל. הפרעות הקשורות לגיל אלה מאופיינים במראה של אגרגטים חלבון עם מבנה fibrillary במוחם של חולים אלו. בדיוק הסיבה חלבונים מסיסים בדרך כלל עוברים תהליך צבירת נשאר ממעטים להבין. גילוי חלבונים צבירת אינה מוגבלת תהליכי מחלה וזה במקום חלק מתהליך הזדקנות נורמלית מאפשר חקר המנגנונים המולקולריים הסלולר המסדירים מצבור חלבון, ללא שימוש ectopically הביע אנושי חלבונים הקשורים למחלה. כאן נתאר מתודולוגיות לבחון צבירת חלבון הגלום ב Caenorhabditis elegans דרך גישות משלימות. ראשית, נבחן כיצד לגדל מספר גדול של גיל-מסונכרנות C. elegans לקבל חיות בגילאי, אנו מציגים את ההליכים ביוכימי כדי לבודד אגרגטים מאוד לא מסיס-גדול. בשילוב עם נוקאאוט גנטי יישוב, זה אפשרי לנתח את התפקיד של גנים של עניין לקדם או למנוע צבירת חלבונים תלויי-גיל באמצעות ספקטרומטר מסה כמותיים או ניתוח מקיף. ניתוח המבוסס על המועמד עם נוגדנים. ממצאים אלה ואז מאושרות על-ידי ניתוח ויוו עם חיות הטרנסגניים המבטאים חלבונים צבירת נוטה מתויג פלורסנט. שיטות אלה צריך לעזור להבהיר מדוע חלבונים מסוימים נוטים צבירה עם הגיל, ובסופו של דבר איך לשמור חלבונים אלה תקינים.
Introduction
חלבון misfolding, צבירת מזוהים בתור סימן היכר של מספר מחלות ניווניות כגון נוירודגנרטיביות (ALS) לספירה, PD, ומובהקת (חדרתי), ועוד רבים אחרים. למשל, הרכבות α-synuclein לתוך הסיבים עמילואיד זה לצבור כמו גופיפי בפרט הסובסטנציה ניגרה של החולים במחלה, ואילו ב- ALS חולים misfold TDP-43 או FUS כדי אגרגטים cytoplasmic טופס המתנוונת מוטורי לגלוקוז. בכל אחד של הפרעות ניווניות אלה, מנגנוני שמירה על הומאוסטזיס חלבון או פרוטוסטאזיס להיכשל כדי למנוע ההצטברות של חלבונים misfolded, וכתוצאה מכך מוביל למחלות.
פרוטוסטאזיס היא קריטית כדי להבטיח תאיים ושליטה בתנאים רגילים מנגנונים רגולטוריים אלה בחוזקה הקצב של סינתזת חלבונים, קיפול, והשפלה. מספר מחקרים מדגימים כי עם ההזדקנות, היכולת של תאים ואיברים רבים, כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון נפרצת בהדרגה, ההידרדרות פיזיולוגיים של הרשתות פרוטוסטאזיס עם הגיל הוא פקטור חשוב מחמירות עבור מחלות ניווניות (נבדקה הפניות1,2,3). העובדה כי את בקרת האיכות של חלבון וגם התגובה התאית פרש חלבון מתח נחשפים עם גיל מציע כי חלבון misfolding, צבירת יכול להיות תוצאה כללית של הזדקנות. אכן, אנחנו ואחרים הראו כי צבירת חלבון אינה מוגבלת למחלות והופך להיות במקום חלק פרוטאום מאוד דטרגנט-לא מסיס חיות בגילאי4,5,6,7 ,8,9,10. ניתוח חישובית, ויוו גילה כי אלה אגרגטים הפיזיולוגיות הקשורות לגיל דומים המחלה אגרגטים היבטים מספר5. הגילוי של צבירת חלבון אנדוגני, תלויי-הגיל נותן לנו את ההזדמנות כדי לנתח את המנגנונים הסלולר המולקולריים המסדירים מצבור חלבון, ללא שימוש ectopically ביטוי חלבונים הקשורים למחלות אנושיות. כיום, קיים מידע מוגבל על התקנון של חלבון נפוץ insolubility ועל ההשפעות של זה dysregulation על הבריאות של האורגניזם.
נמטודות C. elegans הוא אחד האורגניזמים דגם באופן מקיף ביותר למד ב הזדקנות מחקר כמו החיות האלה יש אורך חיים קצר יחסית ולהראות תכונות האופייניות הזדקנות רבות הנהוגות עילאיים. השפעות ההזדקנות על חלבון insolubility נחקרו C . elegans מאת רציפים fractionation הביוכימי בהתבסס על מסיסות דיפרנציאלית, אשר נמצא בשימוש נפוץ להוציא אגרגטים המחלה בתחום של מחקרים הקשורים ניוון מוחיים11 . באמצעות ספקטרומטר מסה כמותית, הוצגו מספר חלבונים מאות להפוך צבירת נוטה C . elegans בהיעדר מחלת5. כאן נתאר בפירוט פרוטוקול לגדול מספרים גדולים של תולעים החילוץ רציפים כדי לבודד חלבונים צבורים על כימות באמצעות ספקטרומטר מסה וניתוח מאת תספיג ותרבות נוזלי. כי חלבונים misfolded של צבירת נוטה להצטבר יישון C. elegans גונדות ומסכות שינויים אחרים רקמות סומאטית5,12,13, נשתמש מוטציה בלוטת המין-פחות להתמקד בניתוח חלבון insolubility ברקמות שאינן-הרבייה. השיטה המובאת המאפשרת הניתוח של אגרגטים גדולים, מאוד לא מסיס מסיסים ב- 0.5% מרחביות, מגורען על ידי מהירות צנטריפוגלי נמוכה יחסית. לחלופין, היה נוהל חילוץ מחמירים פחות לאסוף גם אגרגטים מסיס יותר ויותר שפורסם במקומות אחרים10. בנוסף, אנו מתארים את שיטת להערכת צבירת ויוו C. elegans.
בסך הכל, שיטות אלה בשילוב עם התערבות ב RNA (RNAi) ניתן להעריך את התפקיד של גנים של עניין להתכוונן צבירת חלבונים תלויי-גיל. בשביל זה אנו מתארים את הניתוח של תמציות של תולעים, בגיל צעיר עם ובלי נוקאאוט של חלבון ספציפי עניין באמצעות RNAi. שיטות אלה צריך להיות כלי רב עוצמה כדי לקבוע אילו רכיבים של הרשת פרוטוסטאזיס לווסת את החלבון insolubility. מספר התערבויות מופחתת כמו פקטורי גדילה דמויי אינסולין/אינסולין (IGF) 1 איתות (IIS) הוכחו באופן דרמטי לעיכוב הזדקנות C. elegans 14. אריכות ימים מסלולים לעיתים קרובות לגרום מנגנוני בקרת איכות חלבון, ולכן המסלולים הללו יכול להיות פעיל השפעה על קצב צבירת חלבון. לדוגמה, נדגים צבירת מופחתת חלבון הטמון בבעלי חיים ארוכים על עיכוב של מסלול IIS7.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנחנו מדווחים על מתודולוגיה לבודד אגרגטים חלבון מאוד לא מסיס להזדקן C. elegans נתון RNAi לניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה סופג המערבי. אנו מראים כי שיפור פרוטוסטאזיס על-ידי הפחתת IIS במידה רבה מונעת צבירת חלבונים תלויי-גיל. על-ידי בחירת חלבונים צבירת-מועדים ספציפיים כדי overexpress C. elegans, זה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון את DZNE וגרנט מארי קירי הבינלאומי אפשרות (322120 כדי D.C.D.)
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
