여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.
마지막 십 년간에서 Alzheimer의 질병 (광고) 등 파 킨 슨 병 (PD), 신경 장애의 보급은 성장 했다. 이 나이 관련 무질서는이 환자의 두뇌에 있는 fibrillary 구조 단백질의 모양 특징. 일반적으로 수용 성 단백질을 받을 이유는 정확 하 게 집계 프로세스를 제대로 이해 남아 있습니다. 발견 단백질 집계 질병 프로세스에 국한 되지 않습니다 정상적인 노화 과정의 일부 단백질 집계, ectopically를 사용 하지 않고 조절 분자 및 세포 메커니즘의 연구를 활성화 하는 대신 인간의 표현 질병 관련 단백질입니다. 여기는 상호 보완적인 접근 방식을 통해 꼬마 선 충 에서 고유의 단백질 집계를 검토 하는 방법론에 설명 합니다. 첫째, 우리 세 동물을 얻을 나이 동기화 C. 선 충 의 많은 성장 하는 방법을 검토 하 고 우리는 매우 불용 성-큰 집계 분리 하 생 화 확 적인 절차를 제시. 대상된 유전 최저와 함께, 그것은 홍보 또는 양이 많은 질량 분석 어느 포괄적인 분석을 사용 하 여 연령에 따라 단백질 집계 방지에 관심사의 유전자의 역할을 해 부 수 또는 후보-기반 항 체와 분석입니다. 이러한 결과 다음 형광 태그 집계 하기 쉬운 단백질을 표현 하는 유전자 변형 동물 vivo에서 분석에 의해 확인 됩니다. 이러한 메서드는 특정 단백질은 나 이와 함께 집계 및 궁극적으로 완전 한 기능이 단백질을 유지 하는 방법 하는 경향이 이유를 명확히 하는 데 도움이 됩니다.
단백질 misfolding 및 집계 AD, PD, 루 경화 증 (ALS), frontotemporal 치 매 (FTD), 그리고 많은 다른 같은 여러 신경 퇴행 성 질환의 특징으로 인식 됩니다. 예를 들어, 녹말 체 소에 α-synuclein 어셈블리는 악화 모터 신경에 있는 양식 세포질 집계에 ALS 환자 TDP-43 또는 FUS misfold에 PD 환자의 substantia nigra에 특히 Lewy 몸으로 축적. 각 이러한 신경 퇴행 성 질환, 단백질 항상성 또는 proteostasis를 유지 하는 메커니즘 질병에 따라서 선도 misfolded 단백질의 축적을 방지 하기 위해 실패 합니다.
Proteostasis 세포 기능을 보장 하기 위해 중요 한 이며, 정상적인 조건 하에서 이러한 규제 메커니즘 단단히 단백질 합성, 접는, 그리고 성능 저하의 속도 제어 합니다. 여러 연구 결과 입증 노화, 수 많은 세포와 장기의 단백질 항상성 유지가 점차적으로 손상 된과 나이 proteostasis 네트워크의 생리 적 저하는에 대 한 중요 한 악화 요인 신경 퇴행 성 질병 (참조1,2,3검토). 사실 단백질 품질 관리 및 펼친된 단백질 스트레스 세포 응답 나이 손상 단백질 misfolding 및 집계 노화의 일반적인 결과 수 제안 합니다. 사실, 우리와 다른 증명 단백질 집계는 질병을 제한 하 고 대신는 프로테옴의 일부 세 동물4,,56,7 세제 불용 성 높게 된다 ,8,,910. 계산 그리고 vivo에서 분석 이러한 생리 연령 관련 집계 여러 측면5질병 집계 닮은 밝혔다. 내 인 성, 연령에 따라 단백질 집단의 발견 우리 ectopically 표현된 인간의 질병 관련 단백질을 사용 하지 않고 단백질 집계, 조절 분자 및 세포 메커니즘을 해 부를 기회를 제공 합니다. 현재, 제한 된 정보만 광범위 한 단백질 용해성의 규칙에 대 한 고 생물의 건강에이 dysregulation의 효과 대 한 존재합니다.
선 충 C. 선 충 이 동물 상대적으로 짧은 수명이 있고 더 높은 유기 체에서 관찰 된 많은 특성 에이징 기능을 표시 조사를 노화에서 가장 광범위 하 게 연구 모형 유기 체 중 하나입니다. 용해성 단백질에 노화의 효과 추출 질병 집계 neurodegeneration 연구11의 분야에서 널리 이용 되는 차동 용 해도에 따라 순차 생 화 확 적인 분류에 의해 C. 선 충 에서 연구 . 양이 많은 질량 분석에 의해 몇 백 단백질 집계-경향이 된다 C. 선 충 에 질병5의 부재를 보였다. 여기 우리가 자세히 설명 액체 문화와 서쪽 오 점 하 여 질량 분석 및 분석 하 여 정량화에 대 한 집계 된 단백질을 순차 추출에 벌레의 많은 수를 성장 하는 프로토콜. 집계 하기 쉬운 단백질을 misfolded 세에 축적 하기 때문에 다른 체세포 조직5,,1213에 선 충 C. 생식 선 및 마스크 변경, 우리를 사용 하 여 생식이 돌연변이 단백질 분석 초점 비 생식 조직에 용해성입니다. 제시 하는 방법에는 0.5 %SDS 불용 성 및 상대적으로 낮은 원심 속도 의해 수송과 매우 불용 성, 큰 집계 분석 수 있습니다. 또한 작고 더 녹는 집계 수집 하 덜 엄격한 추출 프로토콜 또는 되었습니다 다른 곳에서10출판. 또한, 집계에서 vivo에서 C. 선 충에 평가 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.
전반적으로, RNA 간섭 (RNAi)와 함께에서 이러한 메서드는 연령에 따라 단백질 집계 변조에 관심사의 유전자의 역할을 평가할 수 있다. 이 대 한 우리와 RNAi를 사용 하 여 관심사의 특정 단백질의 분해 없이 젊고 세 벌레에서 추출의 분석을 설명 합니다. 이러한 메서드는 단백질 용해성을 조절 하는 proteostasis 네트워크의 구성 요소를 결정 하는 강력한 도구 이어야 한다. 여러 중재와 같은 감소 인슐린/인슐린 같은 성장 인자 (IGF)을 극적으로 선 충 C. 노화14지연 표시 1 신호 (IIS). 장 수 경로 종종 단백질 품질 관리 메커니즘을 유발 하 고 따라서 이러한 경로 수 적극적으로 영향을 미치는 수 단백질 집단의 속도. 예를 들어, IIS 경로7의 억제에 따라 수명이 긴 동물에 감소 고유의 단백질 집합을 설명합니다.
여기 우리는 매우 불용 성 단백질 질량 분석 및 서쪽 blotting에 의해 분석을 위한 RNAi를 받게 되는 선 충 C. 노화에서 집계를 분리 하는 방법을 보고 합니다. 우리는 그 연령에 따라 단백질 집계 방지 proteostasis IIS를 크게 줄임으로써 향상을 보여줍니다. 특정 집계 경향이 단백질 C. 선 충에서 overexpress을 선택 하 여 추가 고유의 단백질 집계를 변조 하는 메커니즘을 해 부 수는.
<p class="j…The authors have nothing to disclose.
이 작품은 DZNE와 마리 퀴리 국제 재통합 그랜트 (D.C.D.에 322120)에서 기금에 의해 지원 되었다
Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
RNaseA | Promega | A7973 | solution |
Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
Software | |||
Image analysis software | ImageJ | ||
Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
E.coli strain | |||
OP50 | CGC | ||
RNAi bacteria | |||
L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
C. elegans mutants | |||
CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
C. elegans transgenics | |||
DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |