Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans
Summary
O objetivo do método apresentado aqui é explorar a agregação da proteína durante o envelhecimento normal no organismo modelo c. elegans. O protocolo representa uma poderosa ferramenta para estudar os agregados grandes altamente insolúveis que formam com a idade e para determinar como as alterações em proteostasis impactam agregação da proteína.
Abstract
Nas últimas décadas, a prevalência de doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Parkinson (PD), tem crescido. Estas desordens associadas idade caracterizam-se pelo aparecimento de agregados de proteínas com estrutura fibrilar nos cérebros destes pacientes. Exatamente por isso que as proteínas solúveis normalmente passam por um processo de agregação continua a ser mal compreendido. A descoberta de que a agregação da proteína não está limitada a processos da doença e em vez disso, parte do processo normal de envelhecimento permite o estudo dos mecanismos moleculares e celulares que regulam a agregação da proteína, sem usar ectopically expressa humana proteínas associadas a doença. Aqui descrevemos as metodologias para examinar a agregação da proteína inerente em elegans de Caenorhabditis através de abordagens complementares. Primeiro, nós examinamos como crescer um grande número de idade-sincronizado c. elegans para obter animais envelhecidos e apresentamos os procedimentos bioquímicos para isolar altamente insolúvel-grandes agregados. Em combinação com um nocaute alvo genético, é possível dissecar o papel de um gene de interesse em promover ou impedindo a agregação de idade-dependente da proteína usando qualquer uma análise abrangente com espectrometria de massa quantitativa ou uma análise baseada em candidato com anticorpos. Esses achados são então confirmados por análise na vivo com animais transgénicos expressando proteínas propensas a agregação fluorescente-etiquetadas. Esses métodos devem ajudar a esclarecer por que certas proteínas são propensas a agregação com a idade e, finalmente, como manter estas proteínas totalmente funcional.
Introduction
Enrolamento de proteínas e agregação são reconhecidos como uma marca registrada de várias doenças neurodegenerativas, como AD, PD, esclerose lateral amiotrófica (ela), demência frontotemporal (FTD) e muitos outros. Por exemplo, α-synuclein assemblies para amiloides que se acumulam como corpos de Lewy, particularmente na substância negra de pacientes com DP, enquanto no ALS pacientes TDP-43 ou FUS misfold para agregados citoplasmática de formulário na degeneração de neurônios motores. Cada uma destas perturbações neurodegenerativas, mecanismos de manutenção da homeostase de proteína ou proteostasis falham em evitar a acumulação de misfolded proteínas, consequentemente levando a doença.
Proteostasis é fundamental para garantir funções celulares e em condições normais estes mecanismos reguladores controlam rigorosamente a taxa de síntese proteica, dobramento e degradação. Vários estudos demonstram que, com o envelhecimento, a capacidade de muitas células e órgãos para preservar a homeostase de proteína é gradualmente comprometida e a deterioração fisiológica das redes proteostasis com a idade é um fator agravante importante para doenças neurodegenerativas (revistas em referências1,2,3). O fato de que o controle de qualidade de proteína e a resposta celular ao estresse unfolded da proteína são comprometidos com a idade sugere que o enrolamento de proteínas e agregação podem ser uma consequência geral de envelhecimento. Na verdade, nós e os outros têm demonstrado que a agregação da proteína não está restrita a doença e em vez disso, parte do proteome torna-se altamente detergente-insolúvel em animais envelhecidos4,5,6,7 ,8,9,10. Análise computacional e na vivo revelou que estes agregados fisiológicos relacionadas com a idade se assemelham a agregados de doenças em vários aspectos,5. A descoberta de agregação da proteína endógena, dependente da idade nos dá a oportunidade de dissecar os mecanismos moleculares e celulares que regulam a agregação da proteína, sem o uso de proteínas associadas a doença humanas ectopically expressas. Actualmente, apenas uma limitada informação existe sobre o Regulamento de insolubilidade proteína generalizada e sobre os efeitos desta desregulagem na saúde do organismo.
O nemátodo c. elegans é um dos organismos modelo mais extensivamente estudados na pesquisa do envelhecimento como estes animais têm vida relativamente curta e mostram muitas características de envelhecimento característicos observadas em organismos superiores. Os efeitos do envelhecimento na insolubilidade de proteínas têm sido estudados em c. elegans por sequencial fracionamento bioquímico com base na solubilidade diferencial, que é amplamente utilizada para extrair agregados de doença no campo de pesquisa neurodegeneração11 . Por espectrometria de massa quantitativa, várias centenas de proteínas foram mostradas para tornar-se agregação propensas em c. elegans na ausência de doença5. Aqui descrevemos detalhadamente o protocolo para crescer um grande número de vermes em cultura líquida e a extração sequencial para isolar proteínas agregadas para quantificação por espectrometria de massa e análise por Western blot. Porque misfolded e propensas a agregação de proteínas se acumulam na idade c. elegans gônadas e máscaras alterações em outros tecidos somáticos5,12,13, usamos um mutante gonad-menos para focar a análise da proteína insolubilidade em tecidos não reprodutivos. O método apresentado permite a análise de agregados altamente insolúveis, grandes que são insolúveis em 0,5% SDS e peletizadas por velocidade centrífuga relativamente baixa. Alternativamente, um protocolo de extração menos rigoroso para coletar também agregados menores e mais solúveis tem sido publicado em outro lugar10. Além disso, descrevemos o método utilizado para avaliar a agregação em vivo em c. elegans.
Em geral, esses métodos em combinação com o RNA de interferência (RNAi) podem avaliar o papel de um gene de interesse em modulando a agregação da proteína idade-dependente. Para isso, descrevemos a análise dos extratos de vermes jovens e idosos com e sem a derrubada de uma proteína específica de interesse usando RNAi. Esses métodos devem ser uma ferramenta poderosa para determinar quais os componentes da rede proteostasis regulam a insolubilidade de proteína. Várias intervenções reduziram como fator de crescimento semelhante à insulina/insulina (IGF) 1 sinalização (IIS) têm sido mostrados para atrasar drasticamente c. elegans envelhecimento14. Caminhos de longevidade, muitas vezes induzem mecanismos de controle de qualidade da proteína e, portanto, estes caminhos poderiam ser ativamente influenciando a taxa de agregação de proteínas. Como exemplo, demonstramos a agregação de proteína inerente reduzida em Long-lived animais mediante inibição da via IIS7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós relatamos uma metodologia para isolar agregados de proteínas altamente insolúveis do envelhecimento c. elegans submetidos a RNAi para análise por espectrometria de massa e mancha ocidental. Nós mostramos que melhorar proteostasis, reduzindo grandemente o IIS impede a agregação da proteína idade-dependente. Selecionando a proteínas específicas de agregação-propenso a overexpress em c. elegans, é possível dissecar ainda mais os mecanismos de agregação de proteínas inerente de mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do DZNE e um subsídio de reintegração Marie Curie International (322120 para D.C.D.)
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
References
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