Metoder för att studera förändringar i inneboende Protein aggregering med åldern i Caenorhabditis elegans

Summary

Målet med den metoden som presenteras här är att utforska protein aggregation under normalt åldrande i modell organismen C. elegans. Protokollet utgör ett kraftfullt verktyg att studera de mycket olösligt stora aggregat som bildar med åldern och att avgöra hur förändringar i proteostasis påverkar protein aggregering.

Abstract

I de sista årtiondena, har förekomsten av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD) och Parkinsons sjukdom (PD), vuxit. Dessa ålder-associerade sjukdomar kännetecknas av uppkomsten av protein aggregat med fibrillary struktur i hjärnan hos dessa patienter. Exakt varför normalt lösliga proteiner genomgå en aggregering process är fortfarande dåligt förstådd. Upptäckten att protein aggregering är inte begränsat till sjukdomsprocesser och istället en del av den normala åldrandeprocessen möjliggör studier av molekylära och cellulära mekanismer som reglerar protein aggregering, utan att använda ectopically uttryckt mänskliga sjukdomsassocierade proteiner. Här beskriver vi metoder för att undersöka inneboende protein aggregation i Caenorhabditis elegans genom kompletterande strategier. Först undersöker vi hur man odlar stora mängder ålder-synkroniserad C. elegans att få äldre djur och vi presenterar de biokemiska förfarandena för att isolera mycket-olöslig-stora aggregat. I kombination med en riktad genetisk knockdown, är det möjligt att dissekera rollen av en gen av intresse att främja eller hindra åldersberoende protein aggregation genom att använda antingen en omfattande analys med kvantitativa masspektrometri eller en kandidat-baserad analys med antikroppar. Dessa resultat bekräftas sedan av i vivo analys med transgena djur uttrycker lysrör-taggade aggregation-benägen proteiner. Dessa metoder bör bidra till att klargöra varför vissa proteiner är benägna att aggregat med ålder och i slutändan hur man håller dessa proteiner fullt fungerande.

Introduction

Protein Skellefteåsjukan och aggregering redovisas som ett kännetecken för flera neurodegenerativa sjukdomar som AD, PD, amyotrofisk lateralskleros (ALS), frontotemporal demens (FTD) och många andra. Till exempel, α-synuclein församlingar i amyloida fibriller som ackumuleras som Lewy förkroppsligar bestämt i den substantia nigraen av PD patienter, medan i ALS patienter TDP-43 eller FUS misfold form cytoplasmiska aggregat i degenererande motoriska nervceller. I varje av dessa neurodegenerativa sjukdomar misslyckas mekanismer för att upprätthålla protein homeostas eller proteostasis att förhindra ansamling av felveckning proteiner, följaktligen leder till sjukdom.

Proteostasis är avgörande för att säkerställa cellfunktioner och under normala förhållanden dessa reglerande mekanismer kontrollera tätt proteinsyntes, vikning och nedbrytning. Flera studier visar att med åldrande, många celler och organ förmåga att bevara protein homeostas äventyras gradvis och fysiologiska försämringen av de proteostasis nätverk med ålder är en viktig försvårande faktor för neurodegenerativa sjukdomar (ses i referenser^1,2,3). Det faktum att protein kvalitetskontroll och cellulära svar på ovikta protein stress äventyras med ålder antyder att protein Skellefteåsjukan och aggregation kan vara en allmän följd av åldrande. Ja, vi och andra har visat att protein aggregering är inte begränsad till sjukdom och i stället en del av proteomet blir mycket tvättmedel-olöslig i äldre djur^{4,5,6,7 ,8,9,10}. Beräkningsbiologi och i vivo analys visade att dessa fysiologiska åldersrelaterade aggregat liknar sjukdomen aggregat i flera aspekter⁵. Upptäckten av endogena, åldersberoende protein aggregering ger oss möjlighet att dissekera de molekylära och cellulära mekanismer som reglerar protein aggregering, utan att använda ectopically uttryckta mänskliga sjukdomsassocierade proteiner. För närvarande finns endast begränsad information om regleringen av utbredd protein olöslighet och om effekterna av detta dysreglering på hälsan hos organismen.

Den nematoder C. elegans är en av de mest omfattande studerade modellorganismerna i åldrande forskning som dessa djur har en relativt kort livslängd och visa många karaktäristiska åldrande funktioner hos högre organismer. Effekterna av åldrande på protein olöslighet har studerats i C. elegans av sekventiell biokemiska fraktionering baserat på differentiell löslighet, som ofta används för att extrahera sjukdom aggregat i neurodegeneration forskningsområdet¹¹ . Av kvantitativa masspektrometri visades flera hundra proteiner att bli aggregation-benägen i C. elegans i avsaknad av sjukdom⁵. Här beskriver vi i detalj i protokollet för att växa stort antal maskar i flytande kultur och sekventiella extraktionen att isolera aggregerade proteiner för kvantifiering av masspektrometri och analys genom Western blot. Eftersom felveckning och aggregation-benägen proteiner ansamlas i åldern C. elegans gonader och masker förändringar i andra somatiska vävnader^5,12,13, vi använder en gonad-mindre mutant för att fokusera analysen på protein olöslighet i icke-reproduktiva vävnader. Metoden presenteras möjliggör analys av mycket olösliga i stora aggregat som är olöslig i 0,5% SDS och pelleterat av relativt låg centrifugal hastighet. Alternativt, ett mindre stränga extraktion protokoll att samla också mindre och mer lösliga aggregat har varit publicerad någon annanstans¹⁰. Dessutom beskriver vi den metod som används för att bedöma aggregation i vivo i C. elegans.

Sammantaget kan dessa metoder i kombination med RNA-interferens (RNAi) utvärdera rollen av en gen av intresse för modulerande åldersberoende protein aggregering. För detta beskriver vi analysen av extrakt från unga och äldre maskar med och utan Nedslagning av ett specifikt protein av intresse med hjälp av RNAi. Dessa metoder bör vara ett kraftfullt verktyg för att avgöra vilka komponenter av proteostasis nätverket reglerar protein olöslighet. Flera interventioner såsom minskad insulin/insulin-liknande tillväxtfaktor (IGF) 1 signalering (IIS) har visat sig dramatiskt fördröja C. elegans åldrande¹⁴. Livslängd vägar inducera ofta protein-kvalitet kontrollmekanismer och således dessa vägar kan aktivt påverka andelen protein aggregering. Som ett exempel visar vi minskad inneboende protein aggregation i långlivade djur vid hämning av IIS väg⁷.

Protocol

Obs: För en bättre förståelse av förfarandet bifogas en schematisk av arbetsflödet (figur 1). 1. tillväxt av stort nummer av unga och äldre C. elegans utsätts för RNAi inriktning en gen av intresse Obs: Använd C. elegans temperatur-inducerad sterila gon-2(q388) mutanter (CF2253) att få stora åldern-synkroniserad populationer. Under alla steg är det viktigt att arbeta under delvis sterila förhålla…

Representative Results

Vi använde metoder presenteras här för att utvärdera hur långlivat djur med nedsatt IIS modulera åldersberoende protein aggregering. Genom Western blot (se steg 2.2, snabb olösligt protein utvinning för Western blot analys), Vi analyserade totala och olösliga proteinhalten i ung (dag 3 vuxen) och åldern (dag 18 av vuxenlivet) maskar på kontroll RNAi och RNAi inriktning insulinet / IGF-1-like receptor daf-2. Vi observerade inga stora förändringar i totala proteinnivå…

Discussion

Här rapporterar vi en metod att isolera mycket olösliga protein aggregat från åldrande C. elegans utsätts för RNAi för analys av masspektrometri och Western blotting. Vi visar att förbättra proteostasis genom att minska IIS kraftigt förhindrar åldersberoende protein aggregering. Genom att välja specifika aggregation-benägen proteiner till överuttrycka i C. elegans, är det möjligt att dissekera ytterligare mekanismer modulerande inneboende protein aggregering.

…

Materials

Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1088655	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	09830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4352135	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	393315
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5404000413
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentrator Plus	Eppendorf	5305000304	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158		Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]