Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere
Summary
Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.
Abstract
Son yıllarda, nörodejeneratif hastalıkları, Alzheimer hastalığı (Ah) ve Parkinson hastalığı (PD), gibi yaygınlığı büyüdü. Bu yaş ilişkili bozuklukları protein toplamları bu hastaların beynindeki fibrillary yapısı ile görünümünü ile karakterizedir. Tam olarak normal çözünür proteinler tabi neden bir toplama işlemi kötü anlaşılır kalır. Protein toplama hastalık süreçlerine sınırlı değildir ve bunun yerine normal yaşlanma sürecinin bir parçası protein toplama, ectopically kullanmadan düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları çalışma sağlar keşif insan ifade hastalık ilişkili proteinler. Burada Caenorhabditis elegans doğal protein toplamada tamamlayıcı yaklaşımlar ile incelemek için yöntemleri açıklanmaktadır. İlk olarak, biz yaşlı hayvanlar elde etmek için çok sayıda yaş senkronize C. elegans yetiştirmeyi incelemek ve biz son derece-çözünmez-büyük toplamları ayırmak için biyokimyasal yordamlar mevcut. Hedeflenen genetik nakavt ile birlikte, teşvik ya da yaş bağımlı protein toplama nicel kütle spektrometresi ile ya da kapsamlı bir çözümlemesini kullanarak engelleyen bir gen rolünü incelemek mümkündür veya bir aday tabanlı analiz antikorlar ile. Bu bulgular sonra toplama eğilimli proteinler floresan öğesini ifade Transjenik hayvanlar ile vivo içinde analiz tarafından onaylanır. Bu yöntemler belirli proteinler topluluğu ile yaş ve sonuçta bu proteinler tamamen işlevsel tutmayı yatkındır neden açıklamak yardımcı olmalıdır.
Introduction
Protein misfolding ve toplama bir hallmark reklam, PD, amyotrofik lateral skleroz (ALS), da demans (FTD) ve diğerleri gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıkların kabul edilmektedir. Örneğin, α-synuclein derlemeler amiloid liflerinde içine bu PD hastalarında ALS hastalar TDP-43 veya FUS misfold iken motor nöronların oluşan bozucu formu sitoplazmik toplamları için özellikle de gözlemliyorum nigra Lewy organları olarak birikir. Her bu nörodejeneratif hastalıklar, protein homeostazı veya proteostasis Bakımı mekanizmaları hastalık için sonuç olarak lider misfolded proteinlerin birikimi önlemek başarısız.
Normal şartlar altında düzenleyici mekanizmaların sıkı bir şekilde denetlemesi protein sentezi, katlama ve bozulma oranını ve Proteostasis hücresel işlev görmesini sağlamak için önemlidir. Çeşitli çalışmalarda ile yaşlanma, protein homeostazı korumak yeteneği birçok hücre ve organların yavaş yavaş açığa ve yaş proteostasis ağlarıyla fizyolojik bozulma için önemli bir ağırlaştırıcı faktör olduğunu göstermek nörodejeneratif hastalıklar (başvurular1,2,3‘ te gözden). Protein kalite kontrol ve gelişeceğini protein stres hücresel yanıt yaşla birlikte tehlikeye protein misfolding ve toplama yaşlanma genel bir sonucu olabilir gösteriyor. Nitekim, biz ve diğerleri protein toplama hastalığı için sınırlı değildir ve bunun yerine Proteom parçası çok deterjan-yaşlı hayvanlar4,5,6‘,7 çözünmez olur göstermiştir ,8,9,10. Hesaplamalı ve in vivo analizi bu fizyolojik yaşı ile ilgili toplamları çeşitli yönleri5hastalık toplamları benzer saptandı. Endojen, yaş-bağımlı protein toplama keşfi bize protein toplama, ectopically ifade insan hastalık ilişkili proteinler kullanmadan düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için fırsat verir. Şu anda, bu bozukluk organizmanın sağlık üzerine etkisi ve yaygın protein insolubility düzenlenmesi hakkında sadece sınırlı bilgi bulunmaktadır.
Nematot C. elegans bu hayvanlar nispeten kısa bir ömrü var ve daha yüksek organizmalarda gözlenen birçok karakteristik yaşlanma özellikleri göstermek gibi araştırma yaşlanma içinde en yoğun olarak çalışılan model organizmalar biridir. Protein insolubility yaşlanma etkilerini C. elegans içinde ateş araştırma11 alan hastalık toplamları ayıklamak için yaygın olarak kullanılan farklı çözünürlük göre sıralı biyokimyasal ayırma tarafından incelenmiştir . Nicel kütle spektrometresi tarafından birkaç yüz proteinler toplama C. elegans eğilimli hastalık5yokluğunda olmak için gösterildi. Burada biz ayrıntılı olarak tarif sıvı kültür ve miktar için toplanan proteinler kütle spektrometresi ve analiz tarafından Western blot tarafından izole etmek için sıralı ayıklama solucanlar çok sayıda büyümeye protokolü. Çünkü misfolded ve toplama eğilimli proteinler yaşlı içinde birikir C. elegans gonads ve maskeleri değişikliklerinin diğer somatik dokular5,12,13, erbezi daha az mutant protein analizi odaklanmak için kullanmak Sigara üreme dokularda insolubility. Yöntemi sunulan % 0.5 SDS çözünmez ve nispeten düşük santrifüj hızlı tarafından pelleted son derece çözünmez, büyük toplamları çözümleme sağlar. Alternatif olarak, aynı zamanda daha küçük ve daha fazla çözünür toplamları toplamak için daha az sıkı bir ayıklama Protokolü oldu başka bir yerde10yayınlandı. Ayrıca, C. eleganstoplama vivo içinde değerlendirmek için kullanılan yöntem açıklamaktadır.
Genel olarak, bu yöntemleri RNA müdahale (RNAi) ile birlikte bir gen yaş bağımlı protein toplama oransal ilgi rolü değerlendirebilir. Bunun için biz genç ve yaşlı kurt ve nakavt RNAi kullanarak ilgi belirli bir protein olmayan özler analizini açıklar. Bu yöntemler proteostasis ağ bileşenlerini protein insolubility düzenleyen belirlemek için güçlü bir araç olmalıdır. Birkaç müdahaleler gibi insülin/İnsülin benzeri büyüme faktörü (IGF) azaltılmış 1 (IIS) sinyal gösterilmiştir dramatik C. elegans yaşlanma14geciktirmek için. Uzun ömürlü yolları genellikle protein-kalite kontrol mekanizmaları teşvik ve böylece bu yolları aktif protein toplama oranını etkileyen. Örneğin, sınırlı doğal protein toplama IIS yolu7inhibisyonu üzerine uzun ömürlü hayvanlarda göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada son derece çözünmez protein toplamları RNAi için analiz için kütle spektrometresi ve Western Blot tarafından tabi C. elegans yaşlanma dan izole etmek için bir metodoloji raporu. Biz proteostasis IIS büyük ölçüde azaltarak iyileştirilmesi yaş bağımlı protein toplama engellediğini gösterir. C. elegansiçinde overexpress için belirli toplama eğilimli proteinler seçerek, daha fazla doğal protein toplama oransal mekanizmaları incelemek mümkündür.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser DZNE ve Marie Curie International Reintegration Grant (D.C.D. 322120) fon tarafından desteklenmiştir
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
