应用实时 PCR 技术检测血清和血浆拷贝数
Summary
这篇手稿描述的拷贝数变异分析进行血清或血浆 DNA 使用 real-time PCR 方法。该方法适用于抗去势前列腺癌患者的耐药性预测, 但也可为其他疾病提供信息。
Abstract
血清和血浆细胞游离 DNA (cfDNA) 已被证明是一个信息, 无创的生物标志物的癌症诊断, 预后, 监测和预测的治疗阻力。从雄激素受体 (AR) 基因拷贝数 (CN) 增益是转移性去势抵抗前列腺癌 (mCRPC) 的一个常见事件的假说出发, 我们建议在 cfDNA 中分析这一事件作为一个潜在的预测生物标志物。
我们使用2不同的 real-time PCR 方法和2参考基因 (RNaseP和前1) 在 cfDNA 中评估了AR CN。每种化验组合均使用 60 ng 的 DNA 量。AR利用数字 PCR 技术确定 CN 增益是一种较为准确的方法。CN 变异分析已经被证明在 mCRPC 的设置中对治疗阻力的预测是有帮助的, 但在不同的病人设置中也可以用于其他用途。CN 对 cfDNA 的分析有几个优点: 无创、快速、易于执行, 并从少量的血清或血浆材料开始。
Introduction
血液中的循环细胞游离 DNA (cfDNA) 已被证明是肿瘤诊断、预后、监测和治疗耐药性预测的最理想的生物标志物来源1,2。许多研究表明, 在组织中的 DNA 改变 (突变, 拷贝数变异, 表观修饰) 和对应的血浆样本中发现的1, 证实了循环肿瘤 dna (ctDNA) 的良好一致性初级和转移性肿瘤组织改变的信息3。研究 ctDNA 的可能性因而允许重建基因组重和拷贝数字变异 (cnv) 在具体致癌基因4, 辨认可能的转移的克隆和 subclonal 细胞。CtDNA 已被证明是临床有用的, 特别是癌症治疗监测, 因为它的特定的基因突变和 cnv, 相关的特定靶向治疗5,6。它还克服了组织活检的需要, 并允许在不同的时间在特定的癌症治疗非侵入性的方式获得的结果。
关于前列腺癌, 循环无细胞雄激素受体 (ar) cnv 和治疗反应的阿比特龙和 enzalutamide 的显着相关性已经显示, 表明AR基因复制号 (CN) 在 cfDNA 可能是一个有前途的生物标志物能够预测治疗阻力7,8,9,10,11。利用不同的灵敏度、成本和速度 (e. g、real-time、数字 PCR 和下一代测序), 可以对 ctDNA 中特定基因的 cnv 进行评估。
在这里, 我们描述了一个简单和快速的方法, 基于双相分析的 real-time PCR 技术, 以评估AR CN 在 cfDNA 从血清和血浆样本7,8。我们考虑了两种不同的 PCR 分析设计的两个不同的基因组区域内的内含子5的AR (Xq12) 和其他两个基因, 作为内部标准参考基因已知有一个正常的拷贝数状态在前列腺癌 (RNaseP,位于 14q11;前1, 位于1p34 上。我们选择了两个参考基因, 而不是一个, 以提高精度和灵敏度的结果。每个化验组合 ( AR-assay_1+RNaseP和AR-assay_2+AGO1的组合检测) 的 DNA 数量为 60 ng。三个健康男性的血清或血浆 DNA 样本被汇集并作为校验仪使用。我们考虑了保险丝 #62; 1.5 用于AR增益和 #60; 0.5 用于删除。这种方法的一个主要优点是它是灵活的, 其他基因也可以被评估, 改变标准的内部参考基因, 根据肿瘤类型和特点。
Protocol
Representative Results
Discussion
AR血清和血浆样品中的 CN 分析是一种新的非侵入性方法, 用于去势抗前列腺癌 (不动产) 患者的分层。最近已经证明, AR CN 能够预测不动产患者治疗阿比特龙和 enzalutamide, 化疗前后的结果7,8,9,10。
我们的方法的主要优点是, 该协议是非常简单的执行, 包括只有一个 DNA 隔?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Chiara 莫利纳利和因扎吉 Martignano 在数据分析方面的支持。
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
References
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