Summary
Novas ferramentas para pesquisa de mechanobiology são necessários para compreender o estresse mecânico como ativa vias bioquímicas e elicia respostas biológicas. Aqui, vamos mostrar um novo método para a estimulação mecânica seletiva dos animais imobilizados com uma armadilha de microfluidic permitindo imagens de alta resolução de respostas celulares.
Abstract
Um objetivo central da mechanobiology é entender o efeito recíproco de estresse mecânico em proteínas e células. Apesar de sua importância, a influência do estresse mecânico na função celular é ainda mal compreendida. Em parte, essa lacuna de conhecimento existe porque alguns ferramentas permitem a deformação simultânea de tecidos e células, imagens da atividade celular em animais vivos e eficiente restrição da motilidade em organismos-modelo caso contrário altamente móveis, tais como o nematódeo Caenorhabditis elegans. O pequeno tamanho da c. elegans -los faz um excelente partido para dispositivos de microfluídica-com base em pesquisa, e foram apresentadas soluções para imobilização usando dispositivos microfluídicos. Embora estes dispositivos permitem imagens de alta resolução, o animal é totalmente envolto em polydimethylsiloxane (PDMS) e vidro, limitando o acesso físico para entrega de força mecânica ou eletrofisiológicas gravações. Recentemente, criamos um dispositivo que integra actuadores pneumáticos com um design de captura compatível com microscopia de fluorescência de alta resolução. O canal de atuação é separado pelo canal da interceptação de verme por uma fina membrana PDMS. Este diafragma é desviada para o lado de um verme aplicando pressão de uma fonte externa. O dispositivo pode direcionar os neurônios mechanosensitive individuais. A ativação desses neurônios é fotografada em alta resolução com indicadores de cálcio geneticamente codificado. Este artigo apresenta o método geral usando cepas de c. elegans , expressando o indicador de atividade de cálcio sensíveis (GCaMP6s) em seus neurônios receptores de toque (TRNs). O método, no entanto, não está limitado aos TRNs nem aos sensores de cálcio como uma sonda, mas pode ser expandido para outras células mecanicamente sensíveis ou sensores.
Introduction
O sentido do tato fornece animais com informações cruciais sobre seu ambiente. Dependendo da força aplicada, o toque é percebido como inócuo, prazeroso ou doloroso. A deformação do tecido durante o toque é detectada pelas células especializadas Mecanorreceptor incorporadas na pele que expressam proteínas do receptor, mais comumente canais iônicos. As etapas ligando a percepção da força para ativação de canal de íon durante o toque e a dor não são totalmente compreendidas. Menos ainda se sabe sobre como o tecido da pele filtra deformação mecânica e se mecanorreceptores detectam alterações na tensão ou stress1,2,3. Esta lacuna na compreensão decorre, em parte, a falta de ferramentas adequadas para aplicar estímulos mecânicos precisos para a superfície da pele de um animal vivo enquanto observa as respostas a nível celular. Considerando que a microscopia de força atômica tem sido amplamente utilizada para aplicar e medir forças em células isoladas de4,5 e também para ativar receptores Piezo1 em vida células6, experimentos semelhantes usando animais vivos, especialmente C. elegans, têm sido notoriamente desafiadora devido a mobilidade intrínseca do assunto. Tradicionalmente, este desafio é contornado usando cola de cianoacrilato de veterinária - ou -grau cirúrgico para imobilizar animais individuais em ágar almofadas1,7,8,9. Esta abordagem tem sido produtiva, mas tem limitações relacionadas com a habilidade necessária para a imobilização por colagem e superfície do agar macio na conformidade mecânica. Uma estratégia de microfluídica é uma alternativa gratuita que evita algumas das complicações ligadas à colagem.
O nemátodo c. elegans é um organismo modelo genético cujo sistema nervoso completamente mapeado que, devido ao tamanho do animal, é uma boa opção para tecnologia microfluídica. Oferta de dispositivos baseados em microfluídica a vantagem que os animais caso contrário extremamente móveis podem ser contidos durante a execução de imagens de alta resolução e entrega de estímulos neuro-moduladora relevantes. Com a ajuda de microfluidic tecnologias, vivem animais podem ser imobilizadas sem dano10,11, permitindo o monitoramento da atividade comportamental ao longo da vida inteira de12,13 e de alta resolução imagem de atividade neuronal14,15,16,17. Além disso, muitos neurônios Mecanorreceptor necessários para o sentido de toque e a dor pode ser caracterizado em sua fisiológicas1,8, mecânica4,18,19e molecular nível20,21,22.
C. elegans sentidos suaves estímulos mecânicos para sua parede do corpo usando seis TRNs, três dos quais inervam do animal anterior (ALML/R e AVM) e três dos quais inervam posterior do animal (PLML/R e PVM). As moléculas de canal de iões necessárias para transducing uma força aplicada em um sinal de bioquímico têm sido muito estudadas em seu TRNs8. Este artigo apresenta uma plataforma microfluidic23 que permite que os investigadores a aplicar forças mecânicas precisas na pele de um imobilizado c. elegans lombriga, ao ler a deformação de seus tecidos internos pela imagem latente ótica. Além de apresentar estímulos mecânicos bem definidos, transientes de cálcio podem ser gravados em neurônios Mecanorreceptor com resolução subcellular e correlacionados com características morfológicas e anatômicas. O dispositivo consiste de um canal central de interceptação que mantém um único animal e apresenta sua pele ao lado de seis canais de acionamento pneumático (Figura 1 e Figura 2). Os seis canais estão posicionados ao longo do canal de armadilhas para entregar a estímulos mecânicos para cada um dos seis TRNs do worm. Estes canais são separados da câmara de captura por diafragmas PDMS finos, que podem ser conduzidos por uma fonte de pressão do ar externo (Figura 1). Nós calibrado a deflexão em relação a pressão e fornecer as medições neste artigo. Cada atuador pode ser abordada individualmente e usado para estimular um Mecanorreceptor de escolha. A pressão é fornecida usando uma bomba de pressão piezo-driven, mas qualquer dispositivo alternativo pode ser usado. Nós mostramos que o protocolo de pressão pode ser usado para ativar TRNs na vivo e demonstrar o funcionamento dispositivos adequados para entrega de estímulos mecânicos para adultos c. elegans, carregar animais adultos em dispositivos, realizando a imagem latente de cálcio experiências e analisando os resultados. Fabricação de dispositivo consiste de duas etapas principais: 1) fotolitos para fazer um molde de SU-8; e 2) PDMS para tornar um dispositivo de moldagem. Por uma questão de brevidade e clareza, os leitores são referidos anteriormente publicados artigos e protocolos24,25 para obter instruções sobre como produzir os moldes e dispositivos.
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Protocol
1. dispositivo fabricação
- Baixe o arquivo de máscara (arquivo suplementar 1) e gerar uma máscara de cromo usando um serviço comercial ou instalações in-house. Como a menor dimensão no dispositivo é 10 µm (espessura de membrana do atuador), certifique-se de que a máscara tem resolução suficientemente alta, dentro de ± 0,25 µm, para produzir os recursos.
-
Seguir métodos de fotolitografia padrão SU-8 (por exemplo, referências24,25,26) para fabricar o molde para a posterior produção de dispositivos PDMS; um resumo das etapas está listado abaixo.
Nota: SU-8 é um material fotossensível, quais as referências cruzadas após exposição à luz ultravioleta (absorção máxima ~ 365 nm). Use as instruções do fabricante como ponto de partida para determinar os parâmetros de processamento para o macio-Asse, exposição (UV) e pós-asse.- Depósito de SU-8 2002 sobre uma bolacha de silício e rotação-casaco para uma espessura aproximada de 2 µm, para uma melhor aderência de pequenas estruturas. Macio-asse em uma chapa quente por 1 min a 95 ° C, um pouco over expor a superfície (UV) todo o (~ 100 mJ/cm2) e pós-asse em uma chapa quente por 2 min a 95 ° C.
- Rotação-casaco uma camada espessa de 47-µm de 2050 SU-8 para definir as características do dispositivo. Use uma velocidade de rotação de 500 rpm por 15 s (aceleração de 130 rpm/s) e em seguida 2.000 rpm para 90 s (aceleração de 260 rpm/s). Se necessário, repetir e ajustar a velocidade de rotação para obter a espessura adequada de fotorresiste.
- Macio-asse em uma chapa quente, por 2 min a 65 ° C e, depois, durante 7 minutos a 95 ° C. Expor o fotorresiste de acordo com as instruções do fabricante (~ 160 mJ/cm2) usando um filtro de máscara e passe longo de cromo para garantir que as paredes laterais retas.
- Retire a bolacha e pós-asse em uma chapa quente por 1 min a 65 ° C e durante 7 minutos a 95 ° C.
- Dissolver unexposed SU-8 com o desenvolvedor e limpe com 2-propanol.
- Asse a hóstia em uma placa quente a 180 ° C por 30 min (difícil-Asse) estabilizar fotorresiste características.
-
Fazer uma réplica PDMS do modelo SU-8 usando o padrão réplica métodos27de moldagem.
- Trate o molde de SU-8 com vapor de Triclorometilsilanos (TCMS) para reduzir a adesão PDMS (silanização).
Atenção: TCMS é água-reativo e tóxico.- Coloque a bolacha modelada em um rack de bolacha no exsicador campânula de vácuo em uma capa das emanações livre de água ou reagentes solúveis em água.
- Sob o capô, use um conta-gotas para aplicar 1 gota de TCMS para um prato de vidro e coloque dentro do dessecador.
- Feche a tampa do dessecador e permitir que o vapor de TCMS revestir a bolacha pelo menos 20 min.
- Desabafar e em seguida, abra o dessecador. Abra a tampa do frasco de sino e remover a bolacha usando uma pinça de plástico. Coloque em um barco de folha de Petri ou alumínio para moldagem de réplica PDMS. Descarte de materiais revestidos TCMS nos resíduos perigosos adequado.
- Mix de PDMS (proporção de 10:1) usando 40 g da base polímero e 4G PDMS agente de cura.
- Despeje a mistura sobre o molde de SU-8 e desgaseificar a mistura pelo menos 30 min em uma câmara de vácuo.
- Cura para pelo menos 6 h a 70 ° C em um forno.
- Trate o molde de SU-8 com vapor de Triclorometilsilanos (TCMS) para reduzir a adesão PDMS (silanização).
- Retire PDMS wafer definindo a bolacha horizontal sobre uma superfície plana e cuidadosamente descascando o PDMS. Não dobre a bolacha para cima durante esta etapa, como pode quebrar o molde.
Nota: Adesão incompleta de SU-8 para a bolacha ou incompleta silanização pode resultar na destruição das estruturas SU-8 durante esta etapa. - Corte o PDMS em torno dos dispositivos em fichas individuais tais que os dispositivos caberão em uma lamela de 24 x 60 mm.
- Usando um soco biópsia de 1 mm, fazer buracos na entrada, duas saídas e seis atuadores usando um soco biópsia de 1 mm. Aponta para os círculos de 2 mm de diâmetro em torno das bordas do dispositivo.
-
Circuitos de PDMS Bond para lamínulas de vidro.
- Expor as duas superfícies a plasma de oxigênio 80 W (30 s).
- Coloque delicadamente a superfície exposta do PDMS para a superfície exposta da lamínula para um selo conformal.
- Recoze o dispositivo em uma chapa quente (100 ° C, 10 min).
Nota: Ligação insuficiente pode causar a falha do dispositivo devido ao escapamento.
2. preparação do microscópio
Nota: Animais transgénicos: expressar um indicador de cálcio como GCaMP6s28 ou outra sonda de atividade geneticamente codificado no neuron(s) de interesse (por exemplo, TRN); co expresse uma proteína fluorescente independente de atividade emitem num comprimento de onda diferente para corrigir pequeno lateral e artefatos de movimento fora de foco que surgem devido à estimulação mecânica. O software de análise automatizada faixas e compensa o movimento induzido por alterações na intensidade da sonda atividade. O worm cepas GN69223 (ou AQ323629) express GCaMP6s (ou GCaMP6m) e o tagRFP de cálcio independente sob o controle do promotor do mec-7. Além disso, o GN692 contém a mutação lite-1(ce314), que impede a ativação do TRNs devido ao sensor de luz azul lite-130 durante a excitação da fluorescência GCaMP6s23.
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Criar um sistema de microscópio para excitação simultânea de GCaMP e RFP.
- Usar ou uma fonte de luz contínua e um filtro de excitação de banda dupla que transmite a luz somente ciano e amarelo, ou usar uma fonte de luz que emite apenas comprimentos de onda em uma largura de banda definido como ciano simultânea (0,77 mW) e amarelo (1.21 mW) LED fontes de excitação para excitação simultânea da fluorescência cálcio-dependente e independente, respectivamente.
- Use uma câmera digital para habilitar a gravação de imagens de microscopia.
Nota: a maioria das câmeras vem com um software para aquisição de imagens. Alternativamente, há software livremente disponível que pode ser usado para controlar a câmera e potencialmente também outras partes do sistema de microscopia. - Ajuste a intensidade da excitação, com base na intensidade de fluorescência para evitar saturação de câmera.
-
Use um cubo de fluorescência que dependendo da escolha da fonte de excitação precisa ser equipado com um filtro de excitação.
Nota: Um 488 nm GFP e 580 nm mCherry filtro de excitação foi usado aqui.- Adicione um divisor de feixe para o cubo para refletir luz ciano e amarelo e transmitir luz verde e vermelha.
- Equipar o microscópio com um 10 X objetivo e um objetivo de alta ampliação (por exemplo, 63 X / 1.32 óleo at) para concentrar a luz sobre a amostra de excitação.
- Monte um divisor de feixe na frente da câmera para gravação simultânea do GCaMP e o sinal de cálcio-independente. Certifique-se de que o divisor de feixe tem um espelho dicroico (passe longo, corte a 570 nm) para separar a luz verde e vermelha, usando um filtro de emissão para verde (passante centrado em 525 nm, com largura de 50 nm) e de emissão de um filtro para luz vermelha (passband centrado em 632 nm com 60 nm largura).
- Projeto da fluorescência verde e vermelha para a metade superior (verde) e metade inferior (vermelho), respectivamente da câmera chip (ver Figura 3). Esta orientação é um pré-requisito para o software de análise fornecida.
3. animal preparação
- Preparar a idade-sincronizado jovem adulto ou adulto dia um c. elegans, conforme descrito anteriormente por Porta-de-la-Riva et al 31
- Prepare o chip microfluidic.
- Conecte o reservatório de fluxo de gravidade (~ 60 cm acima do nível da microplaqueta) contendo filtrada buffer de M9 (filtro de seringa de polietersulfona de 0,2 µm) para uma tomada do chip. Conecte a saída de outra para uma tomada de um contentor de resíduos de duas saídas, ou seja, um frasco de filtro. Conecte a outra saída do contêiner de resíduos uma bomba peristáltica.
Nota: Usar tubos de polietileno (PE) para todas as conexões e usar os encaixes de tubo de metal para conectar os tubos de PE para o chip. Desta forma todas as soluções de resíduos serão liberadas sem o chip e recolhidas no recipiente de resíduos. O fluxo através dos canais de saída cria uma sucção suave que manterá o worm confortável durante o processo de captura mais tarde. - Prepare-se interconecta consistindo de 50mm longo PE tubos (OD 0.9652-mm, 0.5842-mm ID) com tubos de metal (medidor de tamanho 23TW, OD 0,635 mm) em ambas as extremidades. Press-fit Estas interconexões em cada um dos seis dedos atuação e na entrada de worm (ver Figura 1). Deixe essas interligações no chip, como remoção repetida leva ao desgaste sobre os buracos PDMS.
- Conecte o reservatório de fluxo de gravidade (~ 60 cm acima do nível da microplaqueta) contendo filtrada buffer de M9 (filtro de seringa de polietersulfona de 0,2 µm) para uma tomada do chip. Conecte a saída de outra para uma tomada de um contentor de resíduos de duas saídas, ou seja, um frasco de filtro. Conecte a outra saída do contêiner de resíduos uma bomba peristáltica.
- Coloque o chip no microscópio. Escolha 2 – 5 vermes em uma gota de filtrado buffer de M9 (filtro de seringa 0,2 µm) e usam uma seringa de 1 mL para atraí-los para um tubo de PE (OD 0.9652-mm, 0.5842-mm ID) ligado a uma seringa de 1 mL, puxando o êmbolo suavemente. Manter os animais dentro do tubo de PE e não na seringa.
Nota: Muitos vermes ou soluções não filtradas no chip podem conduzir à obstrução. - Conecte o tubo de PE da seringa para a interconexão à entrada do worm (Figura 1 e Figura 2) do chip. Ativar o fluxo de gravidade, abrindo a válvula e ligue a bomba peristáltica. Em seguida, pressione suavemente o êmbolo da seringa da seringa para mover os animais para o canal de armadilhagem enquanto observa o canal sob um microscópio com uma lente X 10 no modo brightfield.
Nota: Ocasionalmente aparecem bolhas de ar não representam um problema; Eles são geralmente automaticamente movidos na tomada. Vários animais podem ser "estacionados" na câmara de espera e usados sequencialmente.- Depois de carregar o animal dentro do canal de captura (ver Figura 2), ajuste sua posição suavemente empurrando ou puxando o êmbolo da seringa para posicionar a cabeça do animal em forma cónica da frente do canal.
- Certifique-se de que o worm (adulto dia 1) tem o tamanho certo para ser preso no chip.
- Se o worm não preenche a secção inteira do canal do nariz para perto do final do corpo (não incluindo a ponta da cauda) ou o worm se move ao longo do eixo do canal sem mover o êmbolo da seringa , remover o worm, pressionando o êmbolo da seringa até desaparecer pelo canal da caça com armadilhas e carregar uma nova (consulte a etapa 3.8).
- Alternar para o modo de fluorescência do microscópio e uma lente de ampliação mais elevada (40 X ou superior) e verifique se o axônio do neurônio de interesse vem deitar o diafragma de um dos atuadores. Caso contrário, ajuste a posição do animal puxando ou empurrando o êmbolo. Se isso não ajudar, remover o worm e carregar um novo.
- Focar o corpo celular do neurônio de interesse e se conectar a interconexão do atuador mais próximo para o neurônio no lado anterior do corpo celular para uma bomba de pressão programável usando tubos de PE.
- Se o experimento requer a medição da distância entre o atuador e o neurônio, mova o campo de visão, então ambos são no campo de visão e o channelwall é paralela à borda superior e inferior da imagem.
- Define um protocolo de pressão usando a bomba de pressão programável.
Nota: Este protocolo pode ser ajustado para a experiência desejada.- Comece com uma pressão constante de 0 kPa durante um tempo correspondente a pelo menos 50 imagens da sequência de imagem (necessária para a normalização). Para uma taxa de geração de imagens de 10 Hz, isto corresponde a 5 s. adicionar uma forma de onda desejada de estímulo e pressão e definir o comprimento do estímulo como um segundo passo.
Nota: Para estimular os TRNs, uma onda senoidal de(ou seja, 75 kPa, 10 Hz) sobreposta com um passo (ou seja, 275 kPa) é recomendada como ele gera uma grande resposta neuronal. - Se o experimento requer estímulos adicionais, incluir um período de pelo menos 10 s, a uma pressão constante de 0 kPa entre estímulos. Antes de ligar a bomba de pressão, verifique se que a pressão do instrumento está em constante 0 kPa evitar estimulação acidental do worm antes a experiência.
- Comece com uma pressão constante de 0 kPa durante um tempo correspondente a pelo menos 50 imagens da sequência de imagem (necessária para a normalização). Para uma taxa de geração de imagens de 10 Hz, isto corresponde a 5 s. adicionar uma forma de onda desejada de estímulo e pressão e definir o comprimento do estímulo como um segundo passo.
- Execute o protocolo de imagem e pressão.
- O software de aquisição de imagem da câmera, defina uma sequência de imagens a 10 Hz usando um tempo de exposição de 100 ms para a duração do protocolo de pressão. Ajuste a intensidade de excitação tal que o aumento de fluorescência máxima não saturar a câmera. Salve as imagens como um arquivo *. tif, pelo menos 50 imagens antes do primeiro estímulo para normalização.
- Inicie o protocolo de imagem no software de aquisição de imagem e o protocolo de pressão no software da bomba programável. Durante a gravação, observe se o neurônio de interesse é o ponto mais brilhante em uma área de 10x10 pixels, não se move mais do que 10 pixels em imagens sequenciais e permanece no campo de visão durante a gravação.
Nota: Se isso não for feito, o software de análise irá falhar. Pontos brilhantes (i.e., autofluorescência) ao redor do neurônio fazem gravações dos neurônios difícil de limpar. Para corrigir isso, remover o worm da armadilha e carregar um novo worm no chip. Se o verme se mexer demais, tente uma nova gravação do worm mesmo e observar o movimento da minhoca. Se o problema persistir, o worm pode ser muito pequeno para ser preso. Neste caso, remover este worm e carregar um verme ligeiramente maior para a armadilha. - Se desejar, gravar os sinais de vários neurônios no campo de visão simultaneamente, enquanto os neurônios estão separados pelo menos 10 pixels durante a gravação.
- Para investigar a habituação, realizar o experimento repetidamente em um animal.
- Remova o worm do canal de armadilhagem.
- Se se deseja manter o verme para estudos posteriores, desconecte os pontos de venda do chip para o fluxo de gravidade e o recipiente de resíduos. Pressione o êmbolo da seringa cuidadosamente até que o verme inteiro é empurrado através do canal de armadilhas para o canal de fluxo.
- Continue pressionando o êmbolo da seringa até o animal aparece em uma gota fora do chip. Desconectar a seringa, incluindo os tubos de PE a partir da entrada de worm, usá-lo para aspirar os vermes em gota e transferi-lo em uma placa de ágar.
- Se não se deseja manter o verme, remover o worm, pressionando o êmbolo da seringa até que o verme inteiro é empurrado através do canal de armadilhas para o canal de fluxo; o fluxo de gravidade e a sucção da bomba peristáltica levará o animal fora do chip e para o recipiente de resíduos.
4. análise
- Baixe e instale o mais recente Fiji versão32.
- Baixe e instale a versão mais recente do SDK java.
Nota: Se necessário, excluir ou renomear a pasta java dentro da pasta de Fiji para Fiji usar o compilador de java instalado recentemente. -
Software aberto de Fiji.
- Verifique se o software está executando o compilador java instalado recentemente abrindo ' Plugins | Utilitários | ImageJ | Propriedades de.
- Baixe o arquivo pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, ver arquivo complementar 2).
- Arrastar e soltar o arquivo. Java na janela do software para abri-lo como um plugin.
-
Compilar e executar o arquivo pokinganalyzer*.java as teclas Ctrl + R em Fiji; uma interface gráfica do usuário (cutucando Analyzer) será aberta (Figura 3).
- Clique na aba "Ajuda" e leia sobre os requisitos de software e como realizar a análise. Para começar, selecione a guia "Open video" Especifique o local do arquivo de vídeo para o analisador: clique no botão "Abrir um vídeo", navegue até o local do vídeo e abri-lo.
Nota: O software começa com este guia aberto. Se não é aberta quando se inicia uma nova análise clique na guia "Open video". Se o vídeo é no formato de a.tif, o programa irá abrir o vídeo internamente e exibir a primeira imagem na parte inferior da interface. Se a imagem não é do vídeo que precisa ser analisado, clique no botão "Abrir um vídeo" para abrir um outro vídeo. - Para continuar, clique na guia "Definir ROIs". Nessa guia, defina a posição do TRN. Observe que a primeira imagem do vídeo aberto é exibida na parte inferior desta Tab. Clique no botão "Definir TRN" e clique sobre o neurônio na parte superior da imagem exibida que deve exibir a fluorescência de GCaMP.
- Opcional: Se o atuador estiver visível na metade superior da imagem o programa pode automaticamente controlar a distância entre o neurônio e o atuador se desejado. Por isso, verificar a "definir o atuador?" -caixa, clique no botão "Definir atuador" e clique sobre o atuador na metade superior da imagem.
- Clique na guia "Análise" definir a taxa de aquisição de imagem. Ou digite um número no campo ou clique em cima ou para baixo botões para aumentar ou diminuir o número. Se na aba anterior a "definir o atuador?" -caixa é verificada, definir o tamanho de célula de câmera, a ampliação e o fator binning, então o programa pode calcular a distância.
- Clique no botão "Iniciar análise".
Nota: O programa agora irá acompanhar o neurônio por sua fluorescência na sequência de imagem na metade superior (dependente de cálcio) e na metade inferior (independente de cálcio) da sequência de imagem. Para compensar o movimento do neurônio no plano de gravar o programa vai investigar uma área de 10 x 10 pixels de acordo com a localização do neurônio na imagem anterior para encontrar a posição do neurônio na imagem a seguir. Calculará a fluorescência em ambas as metades corrigindo para a fluorescência de fundo (Fbg) e dividindo por fluorescência nas primeiras 50 imagens (F0):
Alterações de fluorescência no canal verde, dependente da atividade (FCa2 +) que são causadas por neurônio de movimento fora do avião de gravação são então corrigido usando a fluorescência no canal vermelho, independente de atividade (F corr) e o desvio-padrão pré-estímulo de cálcio-dependente (sdCa2 +) e independente da fluorescência (sdcorr) por:
- O programa irá mostrar seu progresso na barra de status na parte inferior da interface; Quando a barra de status atinge 100%, clique na guia "Resultados". Se a barra de status parar antes 100%, o programa dará uma mensagem de erro indicando a razão pela qual que o programa não poderia analisar o vídeo.
- Se o sinal à relação de ruído é muito baixo, o programa não consegue identificar o neurônio; Ajuste os parâmetros de imagem em gravações posteriores.
- Se o neurônio deixa o campo de visão durante a gravação, o programa não pode segui-lo mais e vai parar. Para gravações posteriores, coloca o neurônio no meio do campo de visão no início da gravação.
- Se algumas regiões no campo de visão estão supersaturadas, a análise automatizada irá produzir resultados inválidos. Para gravações posteriores, certifique-se que o sinal de fluorescência não saturar o sensor da câmera.
- Na guia 'resultados', o resultado é exibido na parte superior. Salve um arquivo *. txt separado por tab da tabela resultado clicando em "Salvar a tabela de resultados".
Nota: Esta tabela consiste no tempo em segundos e a fluorescência normalizada de cálcio-dependente (corrigido por fluorescência independente de cálcio). Se anteriormente definido, ele também contém a distância total entre o TRN e o atuador em µm e a distância entre o TRN e o atuador perpendicular à parede do canal em µm. resultados representativos da intensidade da fluorescência aumentam após estimulação versus a distância do corpo celular para o atuador mais próximo são plotados na Figura 4. - Se houver vários neurônios em uma gravação (separada por mais de 10 pixels), clique na guia "Definir ROIs" novamente e volte ao passo 4.6.2 com o segundo neurônio.
- Clique na aba "Ajuda" e leia sobre os requisitos de software e como realizar a análise. Para começar, selecione a guia "Open video" Especifique o local do arquivo de vídeo para o analisador: clique no botão "Abrir um vídeo", navegue até o local do vídeo e abri-lo.
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Representative Results
SU-8 litografia e colagem de Chip
O protocolo de litografia e moldagem de PDMS sigam os procedimentos padrão. Detalhes podem ser encontrados em outros lugares23,24,25,26. O PDMS deve descascar fora a hóstia sem problemas após a cura. Se os recursos de SU-8 arrancar durante o descascamento de PDMS, ou a camada de aderência de SU-8 ou a silanização era insuficiente. Se plasma-ativação das lamelas de vidro e as fichas PDMS não for suficiente, ligação fraca pode resultar em fugas fora do canal de interceptação ou actuadores pneumáticos, resultando em degradação do desempenho e da ausência de estimulação. Se o vazamento de fluido é evidente, o chip está inutilizável.
Desempenho do atuador
Todos os atuadores PDMS e o tubo de conexão do chip para o reservatório de ar devem ser devidamente selados para garantir a adequada atuação pneumática de diafragmas. Repetidas de inserção e remoção do tubo de PE (canalização) danificará buracos PDMS e conduzir a uma diminuição na pressão. Uma grande perda de pressão limitará a deflexão do atuador e a força aplicada sobre a pele do animal imobilizado. Deflexão do diafragma pode ser medido usando um chip vazio (nenhum animal presente) realizando vários ciclos de atuação com a pressão desejada e comparando os valores quantitativos com predições teóricas. A deflexão do diafragma não foi medida na presença de um animal no canal de armadilhagem, porque o limite da membrana e worm são difíceis de Visualizar. Isto faz a calibração de precisão com um animal não é possível. A tabela 1 lista a deflexão esperada em função da pressão. Esses valores foram calculados utilizando a teoria de placa elástica e detalhes podem ser encontrados em Nekimken et al . 23 essa relação deverá variar de acordo com as diferenças de espessura diafragma gerados durante a fundição Microplaqueta e outros fatores tais como a integridade da ligação entre o chip e o vidro e selos conectando o chip para as fontes de pressão. Aqui, os valores foram reprodutíveis com ligeira variação não superior a 1 µm a 450 kPa de pressão. Que têm caracterizado o desempenho dos diafragmas para todos os três perfis diferentes de estímulo e referir o leitor interessado Nekimken et al. 23 , em resumo, lá são vários fatores a considerar se os valores se desviar do quadro 1: 1) um vazamento na tubulação ou conectores de tubos, 2) o PDMS tem uma elasticidade diferente, que pode resultar de uma relação de alternativa de polímero base e agente de cura, ou 3) o PDMS tem envelhecido e continuou a referência cruzada ao longo do tempo. Portanto, recomenda-se uso de fichas que tenham sido elaborados dentro de um mês de sua aplicação.
Interceptação de desempenho
Depois de inserir os vermes na entrada do chip, uma ligeira pressão com a seringa deve colocar um único animal dentro do canal de armadilhagem e apresentar sua pele juntamente com os seis atuadores (Figura 1). Importante, o nariz do animal não precisa necessariamente se projetam para o reservatório de reserva. Em vez disso, é mais importante posicionar o animal como o axônio é adjacente ao actuador mais próximo, sendo seu corpo celular dentro do campo de visão do microscópio. Para conseguir a ativação neuronal ideal, a distância entre o atuador e o corpo celular deve ser ajustada, tal que o atuador encontra-se à frente do corpo celular de interesse. Em nossa experiência, para os neurônios estimulados que posterior ao corpo celular, nenhuma ativação terá lugar e cálcio transientes estarão ausentes. Imobilização adequada pode ser conseguida com o jovens adultas ou uma dias de idade hermafroditas (dispositivos otimizados para estas duas idades estão disponíveis na mesma máscara). Pequenos animais irão escorregar para o reservatório de coleta ou deslocar-se lateralmente dentro do canal de armadilhagem. Animais que são grandes demais vão ser espremidos dentro do canal, que pode resultar em ativação prematura do seu TRNs e subsequente falha para detectar transientes Mecanorreceptor. Também, remoção de grandes vermes é desafiador, levando à morte do animal e/ou obstrução do dispositivo. Com este projeto, o neurônio PLM geralmente não pode ser imobilizado completamente, por isso é livre para se mover lateralmente e verticalmente. Embora com êxito ativamos os neurônios PLM, gravação de transientes de cálcio nestes neurônios é difícil devido ao movimento vertical da cauda. Um outro projeto de armadilhagem serviu para gravar a partir de PLM33.
Imagem de cálcio transientes e análise
Uma vez no lugar, os animais podem ser estimulados usando dentre os seis atuadores. Os seis atuadores estão posicionados para oferecer estímulos mecânicos para cada um dos seis TRNs. Um regulador de caudal microfluidic conectado a uma fonte de pressão interna de 450-kPa foi usado para entregar o animal-um protocolo de estímulo, consistindo de uma etapa de 275 kPa 2-s, rampa 2-s 0 – 275 kPa e um zumbido 2-s (um 75 kPa, 10 Hz senoidal sobreposta com um passo de 275 kPa) , cada um separado por um período de espera de 10-s. As sequências de imagem gravada simultaneamente de transientes do cálcio foram analisadas em Fiji, usando um software personalizada disponível em nossa conta GitHub (veja acima e https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). Nós achamos que rampas de pressão e pressão passos ativado TRNs somente se os estímulos alcançado pressões acima de 400 kPa. Por outro lado, uma ativação robusta de todos TRNs estimuladas usando um buzz sinusoidal, 10 Hz a pressões < 275 kPa foi observada (Figura 4). Em geral, TRNs responderam melhor a um breve estímulo sinusoidal (chamado 'buzz'), de acordo com relatórios anteriores, utilizando diferentes metodologias1,9. A estimulação com um zumbido é altamente eficiente, levando a ~ 90% de ativação em todos os neurônios e ensaios testados (Figura 4). Surpreendentemente, não houve forte correlação observada se o estímulo foi aplicado para o dorsal ou o lado ventral, e era independente da distância entre o corpo da célula e a posição de estímulo sobre o axônio. Estudos futuros terá que investigar se o atraso da resposta máxima se correlaciona com a distância de estímulo.
Figura 1: visão geral sobre o projeto de microplaqueta. (A) layout esquemático da Fotomáscara e o chip resultante com todos os conectores indicados. Existem seis dedos de atuação, três de cada lado do canal central armadilhagem. Barra de escala = 3 mm. (B) fotografia do dispositivo microfluidic com PDMS lig a lamela e conectado à tubulação na entrada do sem-fim e as tomadas do worm. Apenas um dos dedos a atuação é conectado à fonte de pressão, enquanto os outros cinco não estão ocupados. Partes da figura foram reproduzidas de referência23 sob licenças comuns criativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: close-up do canal central armadilhagem e procedimento de armadilhagem. (A) desenho esquemático do canal a caça com armadilhas. Os pilares no lado da entrada de worm ajudam a orientar o worm e facilitar o carregamento dos animais. Os dedos de atuação podem ser pressurizados e recuo de um diafragma fino da amostra preso. Barra de escala = 200 µm. (B) representante quadro de vídeo de um verme que ficar preso no canal horizontal. O canal é projetado tais que o worm vem criar através de seis atuadores pneumáticos. Cauda é à esquerda, está de cabeça para a direita. Localização dos neurônios receptores de toque individual (TRNs) estão indicadas pelas setas e rotulado na figura. Barra de escala = 100 µm (em todos os painéis). Partes da figura foram reproduzidas de referência23 sob licenças comuns criativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: visão geral do plugin Fiji fornecido para analisar traços de cálcio adquiridos com esse protocolo. O software inicia uma interface gráfica do usuário. A primeira aba ("Open video") da interface do usuário mostra o botão abrir um vídeo, ele exibe o caminho e o primeiro quadro do vídeo aberto. A segunda guia ("definir ROIs") inclui o botão para definir um neurônio receptor de toque, uma caixa de seleção para ativar o botão "Definir atuador" e o botão "Definir atuador". Na parte inferior, o primeiro quadro do vídeo é exibido. Na parte superior da terceiro guia ("análise"), são exibidos os parâmetros ajustáveis para a análise de imagem. A parte do meio mostra o botão "Iniciar análise". Na parte inferior, uma barra de progresso mostra o progresso da análise atual. Na quarta aba, "Resultados", o resultado é exibido como um gráfico da intensidade da fluorescência relativo ao longo do tempo. Na parte inferior, há um botão para salvar a tabela de resultado. Na quinta aba, "Help", um texto de ajuda é exibido, mostrando os requisitos para o software de análise e instruções sobre como usá-lo. Figura adaptada de referência23 sob licenças comuns criativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: neurônios individuais respondem a estímulos mecânicos. Micrografia de fluorescência representativo (A) de GCamP6s rotulado neurônio de receptor de toque AVM antes e após a estimulação mecânica com um zumbido. Barra de escala = 10 µm. escala de cor = 1.500-3.500 valores de cinza. (B) protocolo de estímulo, incluindo a excitação de diafragma s 2 que representa um passo de 275 kPa, uma rampa de 275 kPa e um seno (75 kPa; 10 Hz) sobreposta com um passo de 275 kPa (zumbido). (C) rastreamento de intensidade GCamP6s normalizado (média ± SEM como área sombreada) gravado a partir de AVM estimulado com o perfil mostrado em B do tipo selvagem animais (verde, n = 14) e mutante de animais no canal Mecanorreceptor subunidade mec-4 (azul, n = 10), ou seja conhecido para facilitar respostas ao estresse mecânico. Isto indica que os transientes são induzidas por estímulos mecânicos aplicados. Partes da figura foram reproduzidas de referência23 sob licenças comuns criativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Pressão (kPa) | Quer dizer a deflexão (µm) | SD | Esperado de deflexão (µm) |
| 0 | -0.01 | 0.01 | 0 |
| 50 | 0,77 | 0,26 | 0.607143 |
| 100 | 1.57 | 0,58 | 1.21429 |
| 150 | 2.32 | 0.65 | 1.82143 |
| 200 | 3.13 | 0,74 | 2.42857 |
| 250 | 3.86 | 0.79 | 3.03571 |
| 300 | 4.61 | 0.79 | 3.64286 |
| 350 | 5.3 | 0,82 | 4,25 |
| 400 | 5.92 | 0,82 | 4.85714 |
| 450 | 6,43 | 0.75 | 5.46429 |
Tabela 1: espera-se valores de deflexão experimental para pressões aplicadas, variando de 0 – 450 kPa e suas predições teóricas. Dados derivados para um estímulo de passo. Quer dizer ± SD. Estes dados foram adquiridos com um canal de armadilhagem vazio.
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Discussion
Este protocolo demonstra um método de distribuição precisa estimulação mecânica na pele de uma lombriga, presa em um chip microfluidic. Destina-se a facilitar a integração dos estímulos físicos para responder às perguntas biológicas e visa agilizar a pesquisa de mechanobiology em laboratórios biológicos. Esse método amplia anteriores ensaios para avaliar a função dos neurônios mechanosensory em c. elegans. Técnicas quantitativas e semi-quantitativa anteriores medido forças1,34 e comportamento35, mas eram difíceis de integrar-se com imagens de alta resolução de atividade neuronal. Assim, acreditamos que o uso deste chip estende as aplicações atuais e seu desempenho é otimizado para a estimulação dos neurônios necessários para toque suave. Nós aperfeiçoamos a deflexão do atuador para alcance 5 µm, que é um estímulo forte o suficiente para alcançar as respostas neuronais quase máximas. Com pequenas variações, acreditamos que este projeto poderia ser usado para estimular receptores de toque áspero, como nociceptores PVD que inervam o corpo de superfície36.
Modificações e solução de problemas
Se nenhuma sala limpa está disponível para SU-8 litografia, uma caixa de bancada limpa ou estações de macio-litografia de SU-8 equipadas com lâmpadas UV, fogão programável e revestidores de rotação podem ser usadas. Uma alternativa de baixo custo para produção de microfluidic dispositivos que evita a utilização de instalações de sala limpa também podem ser seguido de26.
No design, implementamos uma técnica de captura existente, que imobiliza um único animal em um canal microfluidic. O design da armadilha é adaptado de um dispositivo que é usado para estudar a sensação olfativa no worm36, mas não é a única opção viável para suprimir o movimento de verme. Outras estratégias têm sido relatadas para segurar minhocas em dispositivos microfluídicos: CO2, electrophoretic, imobilização compressiva11,37,38 foram usadas e pode ser integrado em um modificado projeto.
Nós entregamos a pressão para os canais de atuação usando uma bomba de pressão piezoelétrico, comercialmente disponíveis, que podem controlar e entregar até 800 kPa de uma fonte de pressão externa. Estamos ligados a bomba de ar comprimido na pesquisa de construção, que é capaz de fornecer ~ 450 kPa. Se nenhuma fonte de ar comprimido está disponível, poderia ser usado um tanque de gás comprimido, de inerte (e.g., N.2). Isto teria a vantagem de entregar a altas pressões e gerando grandes deformações, mas exigiria também acessórios de alta pressão para se conectar ao controlador de pressão para o chip. Fabricar o chip de PDMS mais suave é uma forma alternativa para aumentar a pressão induzida deformações.
Neste experimento, a saída da bomba de pressão é conectada para o chip PDMS através de aberturas de recebimento de 1 mm (por exemplo, furos de perfurador) conectado com interligações reversíveis e sem cola, consistindo de um metal de 20g press-fit-tubo inserido em um PE tubo. Estas foram mostradas para resistir a pressões de até 700 kPa39. Cuidados devem ser tomados durante a inserção repetida, no entanto, como o PDMS em torno dos orifícios tende a rasgar e, portanto, limitar o desempenho ou inutilizar o chip. Por este motivo, o tubo de metal foi inserido uma vez e deixou plugado o chip, sem remoção e inseri-lo repetidamente.
Passos críticos
Estimulação é entregue por um canal de atuação pressurizado, que recua a pele. A deformação resultante e a ativação do neurônio Mecanorreceptor podem ser fotografadas com alta resolução em um microscópio óptico de fluorescência e/ou set-up confocal. Vários fatores podem dificultar a detecção de respostas GCaMP. Em primeiro lugar, c. elegans expressam um receptor de luz azul30 em muitos neurônios, incluindo TRNs21,,23, que ativa as células após a iluminação com azul (488 nm) luz. Assim, c. elegans de imagem usar o sensor de cálcio geneticamente codificado GCaMP6s ativará seus neurônios sobre iluminação, obscurecendo a transientes de cálcio ativados por estimulação mecânica23. Trabalhando no fundo mutante lite-1 , ou utilizando medidores de atividade de cálcio avermelhado evita este maldito. Em segundo lugar, mecanicamente induzida cálcio transitório talvez não sejam detectado se o perfil de estímulo não coincide com a sensibilidade dos mecanorreceptores. Nós não conseguiram detectar a ativação para etapas de alta amplitude e rampas, mas evocou sinais extremamente elevados após estimulação com estímulos moderados dinâmica (por exemplo, 200 kPa - buzz). Finalmente, TRNs habituate a um estímulos repetidos entregues com short (< 60 s) intervalos de interstimulus. Assim, é importante para sequências de estimulação de projeto que minimizam a habituação, exceto em casos onde a habituação está sendo estudada.
Recomendamos que todas as soluções, a filtragem como detritos e poeira nos buffers facilmente podem obstruir o canal de pequenas armadilhas. Além disso, animais devem ser sincronizado por idade e tamanho correspondente ao projeto do chip; animais menores do que os adultos jovens irão deslizar através do dispositivo ou deixar de ser imobilizados e os animais maiores não entram os canais de armadilhagem e estão em perigo de ruptura e/ou entupimento do chip. Em caso de entupimento, aplicação de pressão excessiva para a entrada de fluxo worm ou gravidade pode limpar os canais, mas também pode levar à falha do encaixe.
Como mencionado na seção resultados, diversos fatores podem levar a uma falha no programa de análise. Se problemas são encontrados na Compilar o código, verificar que o mais recente software de Fiji é executado e que Fiji é usando o compilador de Java mais recente é recomendado. Se o programa estiver sendo executado, mas existem inesperados resultados por favor certifique-se de que o filme gravado tem um buffer de quadro-50 antes que a estimulação mecânica real é executada para garantir uma adequada estimativa da fluorescência de base e plano de fundo. Além disso, o campo de visão de verde, atividade-dependente (GCaMP6s) e o vermelho, canal de actividade independente (tagRFP) são considerados ser projectada a metade superior e inferior do chip câmera, respectivamente. Se o divisor de feixe óptico projeta as imagens sobre a metade esquerda e direita do sensor, vire a câmera 90° para obter a orientação desejada durante a gravação ou rodar as pilhas de imagem em uma etapa de pré-processamento. Além disso, o programa identifica o neurônio por sua fluorescência e falhará se a relação sinal-ruído ou o contraste é muito baixo. Neste caso, alterar o tempo de intensidade e/ou exposição de excitação pode resolver o problema. O programa também irá parar se o neurônio deixa o campo de visão durante a gravação, em que caso o neurônio deve ser posicionado no centro do campo de visão antes de iniciar uma nova aquisição.
Limitações da técnica
O presente projeto permite a estimulação dos neurônios Mecanorreceptor parede corporal como os nociceptores PVD e o TRNs, mas não os mecanorreceptores que inervam a região cabeça do worm, como FLP e cinzas. É limitado a pressões < 700 kPa. Para maiores pressões, encaixes de tubo diferente precisam ser empregado. Desde que o fornecimento de pressão aqui não exceder 500 kPa, a máxima pressão possível aplicar limitou-se a 450 kPa. O cálcio transientes observados aqui marca o limite superior do sinal esperado. Outra limitação para o design de nossos atuadores é sua taxa de proporção. Em princípio, diafragmas mais finos permitiria maiores deformações, mas estruturas com alta taxa de proporção são difíceis de fabricar de forma confiável. Se deformações maiores são essenciais, atuadores mais amplas ou deformações paralelas de ambos os lados podem ser útil, tal como apresentado por Costa et al 29
Embora nós podemos monitorar a deformação do diafragma, é difícil de medir as forças aplicadas durante a estimulação pneumática dos canais de atuação. A limitação do princípio é que a área de contato do atuador não é bem definida. Isso ocorre porque o atuador em si é elástica e deformação durante a atuação, que muda o raio de contato com o aumento da deflexão. Com estas ressalvas em mente, podemos estimar que um recuo de 5 µm (cerca de 300 kPa pressão de atuação em um chip vazio) prevê aplicar µN cerca de 3,8 para o worm de acordo com as estimativas de rigidez do worm de Petzold et al 34 desde a dependência da força da corrente neuronal varia em worms com diferentes stiffnesses1,,34, no entanto, recuo de monitoramento como uma medida de intensidade de estímulo ao invés da força é recomendada.
Esperamos que a divulgação do presente protocolo irá ajudar os usuários aproveitar microfluídica para pesquisa de mechanobiology usando o c. elegans como um sistema de modelo e, assim, acelerar o avanço da ciência sobre este importante assunto no campo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli de Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty e Veronica Sanchez para apoiar no projeto de dispositivo e geração de animais mutantes. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios de NIH R01EB006745 (a BLP), R01NS092099 (para MBG), K99NS089942 (a MK), F31NS100318 (a ALN) e recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação (CEI), sob o Horizonte 2020 pesquisa e inovação da União Europeia (do programa Convenção de subvenção n. º 715243 para MK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
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