Summary

Gebruik van Synaptic zink histochemie onthullen verschillende regio's en Laminae in de ontwikkelingslanden en volwassen brein

Published: October 29, 2017
doi:

Summary

We beschrijven een histochemische procedure die onthult karakteristiek laminaire en areal zink kleuring patronen in verschillende hersengebieden. Het patroon van zink-kleuring kan worden gebruikt in combinatie met andere anatomische markeringen op betrouwbare wijze onderscheiden lagen en regio’s in de ontwikkelingslanden en volwassen brein.

Abstract

Karakterisering van de hersenen van de anatomische en functionele organisatie en ontwikkeling vereist nauwkeurige identificatie van afzonderlijke neurale circuits en regio’s in de onvolwassen en volwassen brein. Hier beschrijven we een zink-histochemische kleuring-procedure die verschillen in kleuring patronen tussen verschillende lagen en hersengebieden onthult. Anderen hebben gebruikt deze procedure niet te onthullen van de verdeling van de zink-bevattende neuronen en circuits in de hersenen, maar ook om af te bakenen met succes areal en laminaire grenzen in de ontwikkelingslanden en volwassen hersenen in verschillende soorten. Hier we illustreren dit kleuring procedure met beelden uit ontwikkelingslanden en volwassen ferret hersenen. We onthullen een zink-kleuring patroon dat als een anatomische markering van gebieden en lagen fungeert, en op betrouwbare wijze kan worden gebruikt om te onderscheiden van de visuele corticale gebieden in de ontwikkelingslanden en volwassen visuele cortex. Het hoofddoel van dit protocol is te presenteren een histochemische methode waarmee de nauwkeurige identificatie van lagen en regio’s in de ontwikkelingslanden en volwassen hersenen waar andere methoden niet in slaagt om dat te doen. Subsidiair, in combinatie met densitometric beeldanalyse, deze methode maakt het mogelijk om te beoordelen van de verdeling van de synaptische zink te onthullen van eventuele veranderingen in de gehele ontwikkeling. Dit protocol beschrijft in detail de reagentia, instrumenten en stappen die nodig zijn om achtereenvolgens vlek bevroren hersenen secties. Hoewel dit protocol wordt beschreven met behulp van ferret hersenweefsel, kan het gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in knaagdieren, katten en apen ook zoals in andere hersengebieden.

Introduction

Histologische vlekken hebben van oudsher gebruikt om te helpen bij de identificatie van de corticale gebieden in verschillende soorten door te onthullen van de verschillen in architectonische kenmerken. Het gecombineerd gebruik van histochemische technieken zoals voor Nissl-substantie, cytochrome oxidase (CO) reactiviteit of myeline kan afwerpen als ze soortgelijke areal grenzen in het volwassen brein onthullen. Echter, deze histochemische vlekken niet altijd adequaat onthullen duidelijke grenzen tussen corticale gebieden en lagen in de onvolgroeide hersenen.

In het centrale zenuwstelsel heeft zink verscheidene kritieke functies waarin het stabiliseren van de DNA-structuur, die fungeert als een enzym cofactor, deelnemen aan diverse regelgevende functie, en fungeert als een neuromodulator door haar aanwezigheid in synaptische vesikels 1. synaptic zink is uniek, omdat het kan worden gevisualiseerd met behulp van de methoden van het histologische, overwegende dat eiwit-gebonden zink niet gevisualiseerde2. Deze functie heeft benut om te onthullen het patroon van de synaptische zink in verschillende corticale gebieden, en synaptische zink histochemie is gebruikt in een aantal studies. Een subset van glutamaterge neuronen in de cortex cerebri bevatten zink in de presynaptische blaasjes binnen hun axon terminals3,4. Histochemische studies is gebleken een heterogene verdeling van synaptic zink in de hersenschors5,6,7. Er lijkt te zijn van een verschillende areal en laminaire verdeling van histochemically reactieve zink in verschillende corticale gebieden (bijvoorbeeldvisuele versus Somatosensorische cortex) of lagen (b.v.zink niveau in de supragranular en infragranular lagen van primaire visuele cortex zijn aanzienlijk hoger dan in thalamocortical invoerlaag IV met relatief lage synaptic zink niveaus)5,8,9. De heterogeniteit in synaptic zink kleuring waargenomen in de cortex is vooral voordelig als het vergemakkelijkt areal en laminaire identificatie.

Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van een synaptic zink histochemische procedure, die een gewijzigde versie van Danscher van 1982 methode10 is. Deze methode maakt gebruik van seleniet geïnjecteerd intraperitoneally (IP) in dieren als een chelaatvormer. De seleniet reist naar de hersenen om te reageren met zwembaden gratis zink in de blaasjes van een subset van glutamaterge synapsen in de hersenen gevonden. Deze reactie resulteert in een neerslag die vervolgens kan worden verbeterd door zilveren ontwikkeling2,10,11.

Deze procedure blijkt laminaire en areal patronen van synaptische zink kleuring; densitometric analyse kan worden gebruikt ter beoordeling van deze patronen zowel kwalitatief en kwantitatief in de volwassen en onvolgroeide hersenen effecten van andere ingrepen, zoals zintuiglijke, milieu, farmacologische of genetische manipulaties te bestuderen. Bovendien kan een ook willen beoordelen van mogelijke ontwikkelings veranderingen in de distributie van synaptic zink in andere corticale en subcorticale structuren in andere modelsystemen. De kwantitatieve gegevens die densitometric analyse in deze methode verschaft kan nuttig zijn voor de volgende ontwikkeling van de hersenen na verloop van tijd. Dit protocol biedt een metgezel te andere immuno – histochemische markeringen te onthullen van laminaire en areal grenzen.

Protocol

het volgende protocol volgt de richtsnoeren van de dierenverzorgers opgericht door de institutionele dier zorg en gebruik Comité (IACUC) aan het City College van New York, die aan alle passende staat en federale richtlijnen voldoen. Narcose is geschikt voor fretten, en moet worden gewijzigd volgens soorten studeerde. Figuur 1: overzicht van de belangrijke stappen…

Representative Results

De grote stappen die betrokken zijn bij dit protocol om vlek hersenen secties voor synaptic zink worden gepresenteerd in een stroomdiagram in Figuur 1. Het protocol kan worden onderverdeeld in drie fasen: 1) perfusie en weefsel collectie 2) weefsel voorbereiding en kleuring en 3) zink histochemie. Kort, tijdens de eerste fase van het protocol, het dier wordt verdoofd en IP met de juiste dosis Natriumseleniet geïnjecteerd. Na een voldoende lange tijdsperiode …

Discussion

De huidige studie maakt gebruik van een histochemische techniek gebaseerd op een gewijzigde versie van de Danscher (1982) methode10, waarbij de lokalisatie van de synaptische zink kan worden gedetecteerd en gevisualiseerd in de hersenen. Deze methode werkt in wezen door het injecteren van het dier met de zink complexvormer Natriumseleniet (nb2van SeO3) (15 mg/kg). Na injectie, de seleniet reist naar de hersenen en bindt aan gratis zink die is gelokaliseerd aan de presynaptisc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Center for onderzoeksmiddelen (2G12RR03060-26A1); Het National Institute on minderheid gezondheid en gezondheid verschillen (8G12MD007603-27) van de National Institutes of Health; Professioneel personeel Congres-City University of New York (PSC-CUNY); en faculteit Research Grant (FRG II) Amerikaanse Universiteit van Sharjah. Wij danken Vidyasagar Sriramoju voor het introduceren van ons aan deze methoden.

Materials

Euthasol (Euthanasia solution) Henry Schein 710101
Sodium selenite Sigma-Aldrich 214485
Ketamine (Ketaved) Henry Schein 48858 100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased) Henry Schein 33198 100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752-500G
Citric acid Sigma-Aldrich C1909
Sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Hydroquinone Sigma-Aldrich H9003
Silver lactate Sigma-Aldrich 85210
Fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506 (Type III, from equine heart)
Catalse Sigma-Aldrich C10
Sucrose Domino
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Permount Fisher Scientific SP15-500
100% Ethanol Fisher Scientific A406-20 Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips Brain Research Laboratories #3660-1
Frosted unsubbed slides Brain Research Laboratories #3875-FR
Microtome American Optical Company 860
Microscope Olympus BX-60
Adope Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images
ImageJ Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ For densometric measurements
Plastic tray Any standard plastic tray may be used to immerse slides in developer solution
Hot plate Any standard hotplate may be used

References

  1. Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
  2. Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
  3. Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
  4. Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
  5. Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
  6. Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
  7. Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
  8. Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
  9. Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
  10. Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
  11. Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
  12. Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  14. Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
  15. Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
  16. Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
  17. Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
  18. Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
  19. Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
  20. Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
  21. Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
  22. Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
check_url/kr/56547?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Khalil, R., Levitt, J. B. Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain. J. Vis. Exp. (128), e56547, doi:10.3791/56547 (2017).

View Video