Brug af Synaptic zink histokemi at afsløre forskellige regioner og bladplader i udviklingslandene og voksen hjerne

Summary

Vi beskriver en histokemiske procedure, der afslører karakteristiske laminar og areal zink farvning mønstre i forskellige hjerneregioner. Den zink-farvning mønster kan bruges sammen med andre anatomiske markører til pålideligt skelne lag og regioner i udviklingslandene og voksen hjerne.

Abstract

Karakterisering af anatomiske og funktionelle hjernen organisation og udvikling kræver nøjagtig identifikation af særskilte neurale kredsløb og regioner i hjernen, umodne og voksen. Her beskriver vi en zink histokemiske farvnings-procedure, der afslører forskelle i farvning mønstre mellem forskellige lag og hjerneregioner. Andre har udnyttet denne procedure ikke blot til at afsløre fordelingen af zink-holdige neuroner og kredsløb i hjernen, men også med held afgrænse areal og laminar grænser i den udvikling og voksen hjerne i flere arter. Her vi illustrere dette farvning procedure med billeder fra udviklingslande og voksne ilder hjerner. Vi afslører en zink-farvning mønster, der fungerer som en anatomisk markør for områder og lag, og pålideligt kan bruges til at skelne mellem visual kortikale områder i udviklingslandene og voksne visuelle cortex. Hovedformålet med denne protokol er at præsentere en histokemiske metode, der giver mulighed for nøjagtig identifikation af lag og regioner i udviklingslandene og voksen hjernen hvor andre metoder mislykkes hertil. Sekundært, sammenholdt med densitometric billedanalyse, denne metode gør det muligt at vurdere fordelingen af synaptic zink til at afsløre potentielle ændringer i hele udvikling. Denne protokol beskriver i detaljer de reagenser, værktøjer og nødvendige skridt til at successivt pletten frosne hjernen sektioner. Selv om denne protokol er beskrevet ved hjælp af ilder hjernevæv, kan det nemt tilpasses til brug i rotter, katte eller aber såvel som i andre områder af hjernen.

Introduction

Histologiske pletter har traditionelt været brugt til at støtte i identifikationen af kortikale områder i forskellige arter ved at afsløre forskelle i arkitektonisk funktioner. Histokemiske metoder såsom kombineret brug for Nissl stof, cytokrom oxidase (CO) reaktivitet eller myelin kan vise sig frugtbar, som de afslører lignende areal grænser i den voksne hjerne. Men disse histokemiske pletter ikke altid tilstrækkeligt afsløre klare grænser mellem kortikale områder og lag i den umodne hjerne.

I det centrale nervesystem har zink flere kritiske funktioner, der omfatter stabilisering DNA struktur, som et enzym cofaktor, deltager i talrige regulerende funktioner, og fungerer som en neuromodulator gennem sin tilstedeværelse i synaptiske vesikler ¹. synaptisk zink er enestående, da det kan visualiseres, histologiske metoder, protein-bundet zink kan ikke være visualiseret². Denne funktion er blevet udnyttet til at afsløre synaptic zink mønster i forskellige kortikale regioner og synaptic zink histokemi har været anvendt i en række undersøgelser. Et undersæt af glutamatergic neuroner i hjernebarken indeholder zink i de præsynaptiske vesikler i deres axon terminaler^3,4. Histokemiske undersøgelser har afsløret en heterogen fordeling af synaptic zink i hjernebarken^5,6,7. Der synes at være en anderledes areal og laminar fordeling af histochemically reaktive zink i forskellige kortikale regioner (f.eks.visuel versus somatosensoriske cortex), eller lag (f.eks.zink niveauer i supragranular og infragranular lag af primære visuelle cortex er væsentligt højere end i thalamocortical input lag IV med relativt lav synaptic zink niveauer)^5,8,9. Heterogenitet i synaptic zink farvning observeret i cortex er specielt fordelagtig, da det letter areal og laminar identifikation.

Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af en synaptic zink histokemiske procedure, som er en modificeret version af Danscher’s 1982 metode¹⁰. Denne metode udnytter selenite injiceres intraperitoneal (IP) til dyr som en chelatdanner. Selenite rejser til hjernen til at reagere med puljer af gratis zink fundet i blærer af et undersæt af glutamatergic synapser i hjernen. Denne reaktion giver et bundfald, der kan forbedres efterfølgende af sølv udvikling^2,10,11.

Denne procedure afslører laminar og areal mønstre af synaptic zink farvning; densitometric analyse kan anvendes til at vurdere disse mønstre både kvalitativt og kvantitativt i de voksne og umodne hjerne at studere virkningerne af andre interventioner, såsom sensorisk, miljømæssige, farmakologiske eller genetiske manipulationer. Derudover kan man også ønsker at vurdere potentielle udviklingsmæssige ændringer i fordelingen af synaptic zink i andre kortikale eller subkortikale strukturer i andre modelsystemer. De kvantitative oplysninger, der densitometric analyse giver i denne metode kan være fordelagtigt for følgende hjernens udvikling over tid. Denne protokol giver en følgesvend til andre immuno- og histokemiske markører for at afsløre laminar og areal grænser.

Protocol

følgende protokol følger dyrs pleje retningslinier af institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) på The City College of New York, som i overensstemmelse med alle relevante statslige og føderale retningslinjer. Anæstesi er relevant for fritter, og bør være tilpasset arter studerede. figur 1: Flowchart beskriver de vigtigste trin involveret i de 3 fase…

Representative Results

De vigtigste trin involveret i denne protokol at plette hjernen sektioner for synaptic zink er præsenteret i et rutediagram i figur 1. Protokollen kan opdeles i tre faser: 1) Perfusion og væv samling, 2) væv forberedelse og farvning, og 3) zink histokemi. Kort, under den første fase af protokollen, dyret er bedøvede og injiceres IP med den passende dosis af natrium selenite. Efter et tilstrækkeligt tidsrum (ideelt 60-90 min.), er dyret efterfølgende eu…

Discussion

Den nuværende undersøgelse beskæftiger en histokemiske teknik baseret på en modificeret version af Danscher (1982) metode¹⁰, hvorved synaptic zink lokalisering kan opdages og visualiseret i hjernen. Denne metode virker primært ved at indsprøjte dyr med zink chelator natrium selenite (Na₂SeO₃) (15 mg/kg). Efter injektion, selenite rejser til hjernen og binder sig til gratis zink, der er lokaliseret til præsynaptiske vesikler zink indeholdende neuroner. Zink-ioner bundet…

Materials

Euthasol (Euthanasia solution)	Henry Schein	710101
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	214485
Ketamine (Ketaved)	Henry Schein	48858	100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased)	Henry Schein	33198	100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute to 4%
Gum arabic	Sigma-Aldrich	G9752-500G
Citric acid	Sigma-Aldrich	C1909
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	W302600
Hydroquinone	Sigma-Aldrich	H9003
Silver lactate	Sigma-Aldrich	85210
Fish gelatine	Sigma-Aldrich	G7765
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506	(Type III, from equine heart)
Catalse	Sigma-Aldrich	C10
Sucrose	Domino
Xylene	Fisher Scientific	X5P-1GAL
Permount	Fisher Scientific	SP15-500
100% Ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips	Brain Research Laboratories	#3660-1
Frosted unsubbed slides	Brain Research Laboratories	#3875-FR
Microtome	American Optical Company	860
Microscope	Olympus	BX-60
Adope Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		To assemble images
ImageJ	Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/		For densometric measurements
Plastic tray	Any standard plastic tray may be used		to immerse slides in developer solution
Hot plate	Any standard hotplate may be used