Bruk av Synaptic sink Histochemistry å avsløre regioner og Laminae i utviklingsland og voksen hjernen
Summary
Vi beskriver en histochemical prosedyre som avslører karakteristiske laminær og areal sink flekker mønstre i forskjellige hjernen regioner. Sink flekker mønsteret kan brukes sammen med andre anatomiske markører pålitelig skille lag og regioner i hjernen utvikle og voksne.
Abstract
Karakteristikk av anatomiske og funksjonelle hjernen organisering og utvikling krever nøyaktig identifikasjon av forskjellige nevrale kretser og regioner i hjernen umodne og voksne. Her beskriver vi en sink histochemical flekker prosedyre som avslører forskjeller i flekker bruksmønstre blant ulike lag og områder av hjernen. Andre har utnyttet denne prosedyren ikke bare å avsløre fordelingen av sink inneholder nevroner og kretser i hjernen, men også å avgrense vellykket areal og laminær grenser i utvikling og voksen hjernen i flere arter. Her vi illustrerer dette flekker prosedyre med bilder fra utviklingsland og voksen oppspore hjerner. Vi avslører et sink flekker mønster som fungerer som en anatomisk markør for områder og lag og pålitelig kan brukes til å skille visuelle kortikale områder i utvikling og voksen hjernebarken. Hovedmålet med denne protokollen er å presentere en histochemical metode som gir nøyaktig identifikasjon av lag og områder i utvikling og voksen hjernen hvor andre metoder ikke gjør det. Sekundært, i forbindelse med densitometric bildeanalyser gjør denne metoden det mulig å vurdere fordelingen av synaptic sink å avdekke mulige endringer i utvikling. Denne protokollen beskriver i detalj reagenser, verktøy og trinn nødvendig suksessivt stain frosne hjernen deler. Selv om denne protokollen er beskrevet ved hjelp oppspore hjernevev, kan det lett tilpasses for bruk i Red, katter, eller aper så vel som i andre områder av hjernen.
Introduction
Histologiske flekker har tradisjonelt blitt brukt å hjelpe med identifikasjonen av kortikale områder i ulike arter av avslørende forskjeller i arkitektoniske funksjoner. Kombinert bruk av histochemical teknikker som Nissl substans, cytochrome oxidase (CO) reaktivitet eller myelin kan bevise fruktbart som avslører de lignende areal grenser i voksen hjernen. Men avslører disse histochemical flekk alltid tilstrekkelig ikke klare grenser mellom kortikale områder og lag i umodne hjernen.
I det sentrale nervesystemet har sink flere viktige funksjoner inkluderer stabilisere DNA struktur, fungerer som et enzym kofaktor, deltar i tallrike regulatoriske funksjoner, og fungerer som en neuromodulator gjennom sin tilstedeværelse i synaptic blemmer 1. synaptic sink er unik som den kan visualiseres ved hjelp av histologiske metoder, mens protein-bundet sink ikke kan bli visualisert2. Denne funksjonen har blitt utnyttet for å avsløre synaptic sink mønsteret i kortikale regioner og synaptic sink histochemistry har vært brukt i en rekke studier. Et delsett av glutamatergic nerveceller i hjernebarken inneholder sink i presynaptic blemmer i deres axon terminaler3,4. Histochemical undersøkelser avdekket en heterogen fordeling av synaptic sink i hjernebarken5,6,7. Det synes å være en annen areal og laminær fordeling av histochemically reaktive sink i kortikale regioner (f.eksvisuelle versus somatosensory cortex) eller lag (f.ekssink nivåer i supragranular og infragranular lag av primære hjernebarken er betydelig høyere enn i thalamocortical input lag IV med relativt lav synaptic sink nivåer)5,8,9. Heterogenitet i synaptic sink flekker observert i cortex er spesielt fordelaktige som det muliggjør areal og laminær identifikasjon.
Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av en synaptic sink histochemical prosedyre, som er en modifisert versjon av Danscher’s 1982 metoden10. Denne metoden bruker selenitt injisert intraperitoneally (IP) til dyr som chelaterande agent. Selenitt reiser til hjernen reagerer med bassenger med gratis sink finnes i blemmer av et delsett av glutamatergic synapser i hjernen. Dette gir en føre som kan forbedres senere av sølv utvikling2,10,11.
Denne prosedyren avslører laminær og areal mønstre av synaptic sink flekker; densitometric analyse kan brukes til å vurdere disse mønstrene både kvalitativt og kvantitativt i voksen og umodne hjernen å studere virkningene av andre tiltak, som sensoriske, miljø, farmakologiske eller genetisk manipulasjoner. Videre kan en også ønsker å vurdere potensielle utviklingsmessige endringer i fordelingen av synaptic sink i andre kortikale eller subkortikal strukturer i andre modellsystemer. Kvantitativ informasjon densitometric analysen gir i denne metoden kan være fordelaktig for følgende hjernens utvikling over tid. Denne protokollen gir en følgesvenn til andre negative og histochemical indikatorer for å vise grenselinjer laminær og areal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien har en histochemical teknikk basert på en modifisert versjon av Danscher (1982) metoden10, der synaptic sink lokalisering kan oppdages og visualisert i hjernen. Denne metoden fungerer i hovedsak ved å injisere dyret med sink chelator natrium selenitt (Na2SeO3) (15 mg/kg). Etter injeksjon, selenitt reiser til hjernen og binder seg til gratis sink som er lokalisert til presynaptic blemmer sink som inneholder neurons. Sink ionene bundet til molekyler innenfor syn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Center for forskning ressurser (2G12RR03060-26A1); National Institute on minoritet helse og helse forskjeller (8G12MD007603-27) fra National Institutes of Health; Profesjonelle ansatte Kongressen-City University of New York (PSC-CUNY); og fakultet forskning Grant (FRG II) American University of Sharjah. Vi takker Vidyasagar Sriramoju for å introdusere oss til disse metodene.
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
