Summary
هنا يصف لنا طريقة قابلة كوانتيتاتي في نفس الوقت وخريطة الجينوم المنظومة ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي سليمة جداً في قرار واحد-النوكليوتيدات، الجمع بين الانقسام الانزيمية للحمض النووي بالتحلل المائي القلوي واللاحقة في نهاية 5´ التسلسل.
Abstract
النهج المتبعة لتقدير عدد ريبونوكليوتيديس موجودة في جينوم تقتصر على كوانتيتيشن ريبونوكليوتيديس إدراج استخدام أجزاء الحمض النووي الاصطناعية قصيرة أو والبلازميدات كقوالب واستقراء النتائج بأكملها ثم الجينوم. بدلاً من ذلك، يمكن تقدير عدد ريبونوكليوتيديس الموجودة في جينوم استخدام المواد الهلامية القلوية أو البقع الجنوبية. استخدام نهج أكثر حداثة في فيفو تسلسل الجيل التالي يسمح لرسم خرائط الجينوم على نطاق المنظومة ل ribonucleotides، توفير موقف وهوية ribonucleotides جزءا لا يتجزأ. ومع ذلك، لا تسمح كوانتيتيشن عدد من ريبونوكليوتيديس التي تدمج جينوم. هنا ونحن تصف كيفية خريطة وكوانتيتاتي عدد ريبونوكليوتيديس التي أدرجت في البشرية الميتوكوندريا الحمض النووي في فيفو بتسلسل الجيل المقبل في الوقت نفسه. نحن نستخدم الحمض النووي الغاية سليمة وإدخال تسلسل حبلا مزدوجة محددة فواصل بهضم ذلك مع اندونوكليسي، ريبونوكليوتيديس إدراج الترشيح في وقت لاحق مع القلوي. الغايات التي تم إنشاؤها هي متصلة مع محولات، وهذه الغايات هي متسلسلة على جهاز تسلسل جيل القادم. ويمكن حساب العدد المطلق ل ribonucleotides كعدد القراءات خارج الموقع الاعتراف الواحدة ومتوسط عدد القراء في موقع التسليم ل endonuclease محددة في التسلسل. هذا البروتوكول قد استخدمت أيضا لوضع خريطة وكوانتيتاتي نيكس مجاناً في الحمض النووي ويتيح تكييف لتعيين سائر الآفات الحمض النووي الذي يمكن معالجته إلى 5´--أوه الأهداف أو الغايات فوسفات 5´. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي كائن حي، نظراً إلى أن يتوفر جينوم مرجعية مناسبة. ولذلك يوفر هذا البروتوكول أداة هامة دراسة تكرار الحمض النووي، وتجهيز 5´-نهاية، وتلف الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي.
Introduction
في خلية حقيقية النواة، تركيز ريبونوكليوتيديس (رنتبس) أعلى بكثير من تركيز ديوكسيريبونوكليوتيديس (دنتبس)1. الحمض النووي [بولمرس] تميز ضد ريبونوكليوتيديس، ولكن هذا التمييز لا يتسم بالكمال، ونتيجة لذلك، يمكن إدراج ريبونوكليوتيديس بدلاً من ديوكسيريبونوكليوتيديس في جينومات أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي. قد يكون ريبونوكليوتيديس النيوكليوتيدات غير المقبول الأكثر شيوعاً التي تدمج الجينوم2. تتم إزالة معظم هذه ريبونوكليوتيديس أثناء نضج يفتت اوكازاكي H2 رناسي ribonucleotide بدأ إصلاح الختان (RER) أو توبويسوميراسي 1 (استعرض في المرجع3). ريبونوكليوتيديس التي لا يمكن إزالتها بالبقاء ستابلي مدرجة في الحمض النووي2،4 وقد تؤثر على نواح الضارة والمفيدة على حد سواء (استعراض في استعراض5). إضافة إلى كونه قادراً على التصرف كإشارات إيجابية، على سبيل المثال في التزاوج نوع التبديل في شيزوساكتشاروميسيس بومبي6 ووسم حبلا الحمض النووي الوليد أثناء عدم تطابق إصلاح (MMR)7،8، ريبونوكليوتيديس تؤثر هيكل9 والاستقرار من الحمض النووي المحيطة بسبب مجموعة الهيدروكسيل 2´ بهم الريبوز10، أدى عدم الاستقرار الإجهاد والجينوم ريبليكاتيفي11. الوفرة من ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي (جدنا) وأهميتها في النسخ المتماثل وإصلاح الآليات، فضلا عن الآثار المترتبة على استقرار المجين، يعطي سببا للتحقيق وقوع دقيقة، والتردد في طريقة على نطاق الجينوم.
لم يتم اكتشاف نشاط H2 رناسي في الميتوكوندريا البشرية وريبونوكليوتيديس ولذلك يتم إزالة عدم كفاءة في الحمض النووي (متدنا). تشترك عدة مسارات في المعروض النيوكليوتيدات إلى الميتوكوندريا البشرية والتحقيق في ما إذا كانت الاضطرابات في بركة النوكليوتيدات المتقدرية يسبب وجود عدد مرتفع من ريبونوكليوتيديس في متدنا البشرية، قمنا بتطوير بروتوكول لخريطة وقوانتيتاتي هذه ريبونوكليوتيديس في متدنا البشرية المعزولة من الليفية، وخلايا هيلا، و خطوط الخلية المريض12.
تستند معظم في المختبر النهج (استعراض في استعراض13) لتحديد الانتقائية الحمض النووي [بولمرس] ضد رنتبس ريبونوكليوتيدي واحد الإدراج أو التمهيدي ملحق التجارب حيث يتم تضمين رنتبس المتنافسة في رد فعل مزيج، السماح بتحديد أو كوانتيتيشن النسبية لإدماج ريبونوكليوتيدي في قوالب الحمض النووي قصيرة. قد لا تعكس تجمعات دنتب ورنتب بتركيزات الخلوية النهج الكمي في تسلسلات قصيرة وذلك توفر نظرة ثاقبة بوليميريز انتقائية بل ذات أهمية محدودة فيما يتعلق بالجينوم كله. فقد ثبت أن مقدار نسبي ribonucleotides إدراجها أثناء النسخ المتماثل من قالب الحمض النووي أطول، مثل بلازميد، يمكن تصور في جل تسلسل باستخدام دنتبس راديولابيليد وهيدروليزينج في الحمض النووي في وسط قلوي14. وعلاوة على ذلك، قد تم تحليلها جدنا في البقع الجنوبية بعد التحلل المائي القلوي، والسماح لسبر حبلا على حدة وتحديد معدلات المطلق لإدماج ريبونوكليوتيدي في فيفو15. تسمح نسبية مقارنة تواتر إدراج هذه النهج لكن تسليم ثاقبة لا موقف أو هوية ribonucleotides مدمجة. نهج أكثر حداثة لتحليل محتوى ريبونوكليوتيدي في جدنا في فيفو، مثل Seq يتميز16Seq الريبوز17، Seq بو18أو19من امريبوسيق، الاستفادة من ribonucleotides المضمنة حساسية القلوية أو معاملة H2 رناسي، على التوالي، وتستخدم تسلسل الجيل القادم لتحديد ريبونوكليوتيديس على نطاق الجينوم. لا توفر هذه الأساليب ثاقبة تواتر إدراج المطلقة ريبونوكليوتيديس تم الكشف عنها. بإضافة خطوة محددة الانقسام الانزيمية تسلسل البروتوكول seq يتميز، الأسلوب يصف لنا هنا مريح يمتد المعلومات المكتسبة من نهج تسلسل، السماح بتعيين واحد وكوانتيتيشن من المضمنة ريبونوكليوتيديس12. هذا الأسلوب ينطبق على أي كائن حي نظراً لأن الغاية سليمة مقتطفات الحمض النووي يمكن أن تتولد ويتوفر جينوم مرجعية مناسبة. الأسلوب يمكن تكييفها مع كوانتيتاتي وتحديد موقع أي الآفة التي يمكن أن يهضم نوكلاس ويترك فوسفات 5´ أو وضع نهاية 5´ يا.
خريطة وكوانتيتاتي ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي، يجمع الأسلوب الانقسام قبل endonuclease محددة تسلسل، والتحلل القلوي توليد 5´-الفوسفات ينتهي في المواقع حيث يوجد تسلسل محددة خاصة بالتعرف اندونوكليسي و 5´- أوه وينتهي في المواقع التي توجد فيها ريبونوكليوتيديس. منذ نهايات الحرة التي تم إنشاؤها هي متصلة في وقت لاحق مع محولات والتسلسل باستخدام تسلسل الجيل القادم، أنها ذات أهمية لاستخدام الحمض النووي الغاية سليمة وتجنب تجزئة عشوائي أثناء إعداد مكتبة واستخراج الحمض النووي. يسمح تقييم هذه القراءات تطبيع ليقرأ في مواقع الانقسام اندونوكليسي كوانتيتيشن المتزامن ورسم الخرائط من ريبونوكليوتيديس تم الكشف عنها. يتم الكشف عن 5´ الحرة--ينتهي في تجارب التحكم حيث يتم استبدال التحلل المائي القلوي للحمض النووي بالمعاملة مع بوكل. توفر نظرة ثاقبة موقع ريبونوكليوتيدي وكمية البيانات المكتسبة ويسمح التحاليل فيما يتعلق بتكرار المحتوى ودمج ribonucleotide.
Protocol
هذا البروتوكول هو المبين في الشكل 1، ويتضمن عزل جدنا، الهضم مع إنزيمات التقييد ليتمكن من كوانتيتاتي عدد ريبونوكليوتيديس، العلاج بمادة قلوية يتحلل روابط phosphodiester ribonucleotides تدمج جدنا، الفسفرة الغايات 5´ الحرة--أوه، ssDNA ربط محولات، والثانية حبلا التوليف والتضخيم PCR قبل التسلسل.
1-محولات والإشعال مؤشر
- كبسولة تفجير مؤشر الحصول على ARC49، النوكليوتيد ARC140، ARC76/77، ومحول و ARC78-ARC107 (انظر الجدول 1).
ملاحظة: يجب أن يكون النوكليوتيد [هبلك] تنقيته. يتم ترتيب ARC76/77 الوجهين. - إعداد 100 ميكرومتر حلول الأسهم لكل اليغنوكليوتيد في تريس يدتا (TE) المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد 10 ميكرون الحلول ARC67/77 و 2 ميكرومتر الحلول كبسولة تفجير ARC49 وفهرس بتمييع في المخزن المؤقت شطف (EB؛ انظر الجدول للمواد). مخزن في-20 درجة مئوية.
2. النمو والحصاد من الخلايا
- خلايا "هيلا تنمو" في 70 مل دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% مصل البقر الجنين في قارورة 250 مل زر الزيادة ونقصان في 37 درجة مئوية.
- حساب عدد الخلايا وجمع 5 × 10 6 خلايا في أنبوب 50 مل، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 س ز، وتجاهل المادة طافية.
- تغسل الخلايا مع 20 مل س 1 برنامج تلفزيوني، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 س ز، وتجاهل المادة طافية.
- تجميد الكريات في-20 درجة مئوية، أو أن تواصل مع تنقية الحمض النووي-
3. تنقية الحمض النووي وكوانتيتيشن
- تنقية جدنا باستخدام الفينول كلوروفورم الاستخراج كما هو موضح أدناه.
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لتحلل 2 مل (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 42 درجة مئوية في كتلة تدفئة.
تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت لتحلل المكونات الخطرة. حل الحزب الديمقراطي الصربي مزعجة، "ك بروتيناز" توعية والمهيجة والسامة. ارتداء ملابس واقية وقفازات. - تقسيم العينة في أنبوبين 2 مل وإضافة المجلد 1 (الخامس) الكحول الفينول-كلوروفورم-إيسواميل (25:24:1)-
تنبيه: الفينول-كلوروفورم-إيسواميل الكحول السامة، مطفرة والتآكل وخطرة على البيئات المائية. استخدم في غطاء دخان وارتداء ملابس واقية وقفازات وتجاهل في النفايات الخاصة الفينول-كلوروفورم.
ز - مزيج من انعكاس على 30-60 ثانية والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في س 15,000 في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: لا دوامة الحمض النووي لتجنب إدخال فواصل حبلا العشوائية، التي تشوه النتائج. - نقل المرحلة العليا، مائي لأنبوب 2 مل جديدة وإضافة 1 V الكحول الفينول-كلوروفورم-إيسواميل (25:24:1)-
- ميكس بانعكاس والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 15,000 ز خ 4 ° C.
- نقل المرحلة العليا، مائي أنبوب مل 2 جديدة وإضافة 20 ميليلتر كلوريد الصوديوم (5 م) و 1 V من الايزوبروبانول الباردة.
تنبيه: الايزوبروبانول القابلة للاشتعال، ومزعجة، وسمية. قم بتخزينها في خزانة التهوية وارتداء ملابس واقية وقفازات وإبقائه بعيداً عن السنة اللهب. - ميكس بانعكاس واحتضانها لمالا يقل عن 1 ح في-20 درجة مئوية.
- الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة مبلغ 000 15 × ز، 4 درجة مئوية وتجاهل المادة طافية.
- بيليه "يغسل الحمض النووي" مع 200 ميليلتر الباردة 70% إيثانول، الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 15,000 س ز في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
تنبيه: إيثانول 70% قابلة للاشتعال ومزعجة. تبقى الحل العامل في-20 درجة مئوية، وخلاف ذلك من متجر في مجلس الوزراء التهوية وارتداء ملابس واقية وقفازات، وإبقائه بعيداً عن السنة اللهب. - الجاف لبيليه الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة ل 20-25 دقيقة
- الكريات "يحل الحمض النووي" في 100 ميليلتر TE المخزن المؤقت وتجمع العينات في أنبوب واحد.
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لتحلل 2 مل (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 42 درجة مئوية في كتلة تدفئة.
- تركيز "الحمض النووي كوانتيتاتي" باستخدام كاشف كوانتيتيشن دسدنا حسب الشركة المصنعة ' مواصفات s (انظر الجدول للمواد)-
ملاحظة: استخدم كاشف كوانتيتيشن دسدنا، لأن سبيكتروفوتوميتريك كوانتيتيشن الحمض النووي يمكن أن تتأثر بالفينول المتبقي. - "تخزين الحمض النووي" في-20 درجة مئوية أو مواصلة العلاج هينسي.
4. العلاج هينسي والتحلل المائي القلوي
- دايجست 1 ميكروغرام من الحمض النووي في رد فعل مزيج يحتوي على 5 ميليلتر 10 x العازلة 3.1، 1 ميليلتر (10 ش) هينسي، وخالية من نوكلاس ح 2 س إلى وحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر.
ملاحظة: لتحقيق الظروف المثلى لربط، الثانية حبلا التوليف والتضخيم بكر، قد يلزم زيادة كمية الحمض النووي الإدخال إذا كان من المتوقع أن الحمض النووي يحتوي على عدد قليل جداً من ريبونوكليوتيديس. وبالمثل، قد يكون من الضروري لتقليل إدخال الحمض النووي وإذا كان العدد ريبونوكليوتيديس عالية جداً- - احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- "هينسيي تنقية" الحمض النووي يعالجون الخرز باراماجنيتيك.
ملاحظة: الاحتفاظ بالانبوب فتح الأغطية في الخطوات التالية لعدم الإزعاج الكريات بفتح الأنابيب.- إضافة 1.8 V من حبات باراماجنيتيك لكل عينة ومزيج دقيق من بيبيتينج، واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10
- استخدام رف مغناطيسي لبيليه الخرز لمدة 5 دقائق، ثم إزالة وتجاهل المادة طافية.
- يغسل بيليه مع 150 ميليلتر من الإيثانول 70% (درجة حرارة الغرفة) لحوالي 30 ثانية ثم إزالة وتجاهل المادة طافية.
- أغسل بيليه مع 200 ميليلتر من الإيثانول 70% (درجة حرارة الغرفة) لحوالي 30 ثانية ثم إزالة وتجاهل المادة طافية.
ملاحظة: يمكن إزالة الإيثانول المتبقية مع ماصة 10 ميليلتر. يمكن نسج قطرات أسفل بإيجاز مسبقاً. - الجاف للعينات في درجة حرارة الغرفة لحوالي 15-20 دقيقة
ملاحظة: الوقت المحدد يعتمد على حجم الخرز وشكل بيليه، لذلك يجب فحص الكريات بصريا. - إزالة أنابيب من الرف المغناطيسية والوتي بيليه في 45 ميليلتر EB، مزيج من قبل بيبيتينج بعناية-
- احتضانها لمدة 5 دقائق ثم بيليه الخرز على الرف المغناطيسي واستخدام 45 ميليلتر لتنقية الحمض النووي في الخطوة 4، 4-
- إضافة 5 ميليلتر من كوه (3 م) أو بوكل (م 3) للحمض النووي إنشاء إجمالي حجم 50 ميليلتر.
تنبيه: 3 "م كوه" الحل التآكل. ارتداء ملابس واقية وقفازات. - إينكوباتي ح 2 في 55 درجة مئوية في تهجين فرن تليها 5 دقائق على مدت
ملاحظة: من المستحسن القيام بمعاملة كوه في فرن بدلاً من كتلة تدفئة للحفاظ على تدفئة موحدة للأنبوب ومنع التكثيف في الغطاء. - "يعجل الحمض النووي" عن طريق إضافة خلات الصوديوم ميليلتر 10 (3m, درجة الحموضة = 5.2) و 125 ميليلتر الباردة الإيثانول 100%. تبني على الجليد للحد الأدنى 5
تنبيه: الإيثانول 100 ٪ قابلة للاشتعال ومزعجة. تخزين في خزانة التهوية وارتداء ملابس واقية وقفازات والابتعاد عن النيران- - بيليه جدنا من سينتريفوجينج في س 21,000 ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. بيليه
- "يغسل الحمض النووي" مع 250 ميليلتر الباردة 70% EtOH، الطرد المركزي في س 21,000 ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتجاهل المادة طافية.
ملاحظة: لإزالة قطرات، الأنبوب يمكن أن تكون نسج أسفل بإيجاز مرة أخرى ويمكن إزالة المادة طافية مع ماصة 10 ميليلتر. - اسمحوا بيليه الجاف في أنبوب مفتوحة لحوالي 5-10 دقائق حتى يتبخر السائل مرئية أي.
- حل بيليه "ترك الحمض النووي" في 20 ميليلتر المجلس التنفيذي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
5-5´ "نهاية الفسفرة"
- إعداد مزيج رد فعل لسلبيات كل عينة مقدماإيستينج ميليلتر 2.5 10 x T4 بولينوكليوتيدي كيناز رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميليلتر (10 ش) 3´-الفوسفاتيز-ناقص T4 بولينوكليوتيدي كيناز، و 2.5 ميليلتر ATP (10 مم)-
- ميليلتر 19 نقل الحمض النووي كل عينة في أنبوب 200 ميليلتر جديدة وتجريدها لمدة 3 دقيقة في 85 درجة مئوية في حرارية-cycler.
- الحمض النووي بارد عينات على الجليد وإضافة 6 ميليلتر من رد فعل مزيج لكل عينة.
- إينكوباتي رد فعل يمزج في 37 درجة مئوية و 30 دقيقة وتوقف رد فعل حضانة العينات عند 65 درجة مئوية عن 20 دقيقة
- "تنقية الحمض النووي" كما هو موضح في 4.3، استخدام 1.8 V من حبات باراماجنيتيك ولكن الوتي في 14 ميليلتر EB.
6. سدنى ربط
- إعداد مزيج رد فعل لكل عينة مكونة مسبقاً من 0.5 ميليلتر ATP (2 مم)، 5 ميليلتر 10 × الجيش الملكي النيبالي T4 ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت، 5 ميليلتر كوكل 3 (NH 3) 6 (10 ملم)، 0.5 ميليلتر ARC140 (100 ميكرومتر)، و 25% 50 ميليلتر 8000 ربط. مزيج جيد من قبل بيبيتينج-
تنبيه: كوكل 3 (NH 3) 6 مسببة للسرطان، وتوعية وخطرة على البيئة المائية. ارتداء ملابس واقية وقفازات. - نقل 13 ميليلتر لتنقية الحمض النووي من خطوة 5.5 إلى أنبوب 200 ميليلتر جديدة وتجريدها لمدة 3 دقيقة في 85 درجة مئوية في حرارية-cycler.
- باردة الحمض النووي على الجليد وإضافة 36 ميليلتر من رد فعل مزيج لكل عينة، مزيج من بيبيتينج، وتدور إلى أسفل بإيجاز-
- إضافة 1 ميليلتر (10 U) من "الحمض النووي الريبي T4 ليجاسى" لكل رد فعل، مزيج من بيبيتينج، وتدور إلى أسفل بإيجاز-
- احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة في ليل الظلام-
7. توليف حبلا الثانية
- نق متصلة الحمض النووي كما هو موضح في 4.3، ولكن استخدام 0.8 الخامس من حبات باراماجنيتيك وبيليه الخرز لمدة 10 دقائق والوتي في 20 ميليلتر EB.
ملاحظة: بسبب اللزوجة أعلى من هذا المزيج رد فعل ربط، أول خطوة بيليتينج أمده. - نقل 20 ميكروليتر من عينة الحمض النووي لأنبوب بكر 200 ميليلتر جديدة. كرر الخطوة تنقية 0.8 الخامس من حبات باراماجنيتيك عقب الشركة المصنعة باستخدام ' مواصفات s والوت في 14 ميليلتر EB.
- إعداد مزيج رد فعل لكل عينة مقدما تتكون من 2 ميليلتر من 10 x T7 دنا بوليميريز رد فعل المخزن المؤقت، 2 ميليلتر ARC76/77 (2 ميكرومتر)، 2 ميليلتر دنتبس (2 مم)، و 0.8 ميليلتر من جيش صرب البوسنة (1 ملغ/مل).
- ميليلتر 12.8 نقل تنقية الحمض النووي لأنبوب 200 ميليلتر جديدة، وتجريدها لمدة 3 دقيقة في 85 درجة مئوية في حرارية-cycler.
- باردة الحمض النووي على الجليد وإضافة 6.8 ميليلتر من رد فعل مزيج لكل عينة، ومزيج من بيبيتينج، وتدور إلى أسفل بإيجاز، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- إضافة بوليميراز الدنا T7 ميليلتر (4 U) 0.4 لكل رد فعل، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- "تنقية الحمض النووي" كما هو موضح في 4.3، استخدام 0.8 الخامس من حبات باراماجنيتيك والوت في 11 ميليلتر EB.
8. [بكر] تضخيم ومكتبة كوانتيتيشن
أنبوب ميليلتر- تحضير مزيج رد فعل لكل عينة في 200 جديدة المكونة مسبقاً من 7.5 ميليلتر ARC49 (2 ميكرومتر)، 7.5 ميليلتر الفهرس التمهيدي (2 ميكرومتر، فريدة من نوعها لكل عينة)، و 25 ميليلتر 2 × بداية ساخنة ميكس جاهزة.
- إضافة 10 ميليلتر من عينات الحمض النووي لكل رد فعل. تضخيم المكتبة باستخدام الشروط التالية: تجريدها في 95 درجة مئوية ل 45 s، تليها دورات 18 98 درجة مئوية لمدة 15 ق، 65 درجة مئوية لمدة 30 s، 72 درجة مئوية لمدة 30 ق، تنتهي استطالة نهائي عند 72 درجة مئوية لعينات عقد 2 كحد أدنى في درجة 4 ج بعد التضخيم.
- تنقية المكتبات كما هو موضح في 4.3، استخدام 0.8 الخامس من حبات باراماجنيتيك، والوت في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات ميليلتر 20-
- كوانتيتاتي المكتبات باستخدام كاشف كوانتيتيشن دسدنا، وفقا للشركة المصنعة ' مواصفات s (انظر الجدول للمواد)-
- تخزين العينات في-20 درجة مئوية، أو أن تواصل مع تحليل مكتبة.
9. مكتبة تحليل وتجميع
- تحديد الجودة لكل مكتبة وتقدير حجم جزء متوسط استخدام نظام التفريد رقمي.
ملاحظة: يتم تقييم حجم جزء متوسط بتقدير أين هو النصف المنطقة تحت منحنى اليكتروفيروجرام، متجاهلة قمم من علامات. وترد نتائج تمثيلية لملفات المكتبة بشكل ملائم بعد العلاج كوه أو بوكل في الشكل 2 ألف- - حساب التركيز (nM) المكتبات ك:
/(p*650) (10/ج 3)] * 10 9
حيث c هو تركيز المكتبة في نانوغرام/ميليلتر وف هو حجم جزء متوسط في شركة بريتيش بتروليوم، المقدرة في 9.1.
تضخم - بركة المولى كميات متساوية من المكتبات تصل إلى 24 مع الإشعال مؤشر مختلفة للتسلسل. إضافة المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات لوحدة تخزين نهائي من 25 ميليلتر وتركيز 10 نانومتر.
ملاحظة: اعتماداً على عدد المكتبات تجميع، يتم ضبط كمية الحمض النووي من كل مكتبة. إذا تم الكشف عن مبلمر في الخطوة 9.1 كذروة متميزة من حوالي 130 شركة بريتيش بتروليوم، وحدة التخزين النهائي تجمع المكتبة يمكن أن تتجاوز 25 ميليلتر، لأنه يتم تكرار الخطوة تنقية كما هو موضح في 4.3، استخدام 0.8 الخامس من حبات باراماجنيتيك، والحمض النووي هو الوتيد في 25 ميليلتر TE buf فر.- تحديد تركيز تجمع مكتبة جديدة باستخدام كاشف كوانتيتيشن دسدنا حسب الشركة المصنعة ' مواصفات s والمتوسط ذروة الحجم كما هو موضح أعلاه. الشروع في تحليل البيانات والتسلسل (المادتان 10 و 11)-
10. التسلسل
- إجراء تسلسل نهاية إقران 75-قاعدة على المكتبات المجمعة 12-
11-"تحليل البيانات"
- تقليم كل القراءات لإزالة محول متواليات، تصفية للجودة وقراءة طول.
ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك باستخدام كوتادابت 1.2.1 20 مع الأمر 'فستق-و كوتادابت-مباراة-القراءة-البدل-هادئة-م 15-س 10-نننننن < ملف >'، حيث يتم استبدال نننننن مع تسلسل المحول الفعلي و < الملف > هو استبدال مع اسم الملف فاستق- - إزالة الأصحاب القراءات التي تم إهمالها في الخطوة السابقة باستخدام البرامج النصية المخصصة.
- أزواج محاذاة 1 رفيقه المتبقية إلى فهرس يحتوي على تسلسل جميع النوكليوتيد المستخدمة في إعداد المكتبة (مثلاً، استخدام Bowtie 0.12.8 21 وسطر الأوامر خيارات-m1-v2). تجاهل كافة أزواج مع التحالفات الناجحة.
- محاذاة أزواج المتبقية للجينوم مرجع الكائن باستخدام Bowtie مع سطر الأوامر خيارات-v2-X أفضل 10000--
- يقرأ الخريطة التي تمتد بين جزيء المتقدرية بداية ونهاية بمحاذاة 1 رفيقه لجميع أزواج الوسط (استخدام Bowtie مع سطر الأوامر خيارات-v2)-
- تحديد عدد 5´-ينتهي لكل نهاية واحدة وإقران التحالفات. تحول موقف هذه بقاعدة واحدة أعلى النهر إلى الموضع حيث كانت ريبونوكليوتيديس طحين.
- تصدير البيانات من ملف bowtie تنسيق إلى تنسيق ملف بيدجراف باستخدام البرامج النصية المخصصة للتصور المشترك المتصفحات الجينوم. تطبيع على ما يلي لكل حبلا ليقرأ كل مليون-
- باستخدام الموضع والتهم من الملف بيدجراف، مرجع تسلسل الجينوم الكائن لتحديد هوية incorpأوراتيد ريبونوكليوتيديس-
ملاحظة: للجينوم البشري المتقدرية يقرأ من المناطق 16,200-300 و 5,747-5,847 لكل حبلا ينبغي أن تستبعد هذه المناطق تحتوي على العديد من الحرة 5´--ينتهي لا علاقة لها بإدراج ريبونوكليوتيدي من دنا بوليميريز γ. - تقسيم ما يلي: الإجمالي، لا بما في ذلك ما يلي: في مواقع هينسي الإحدى عشرة، ومع متوسط عدد القراءات كل موقع هينسي للحصول على عدد ريبونوكليوتيديس كل فاصل جديلة واحدة، (أي عدد ريبونوكليوتيديس كل جزيء mitochondrial).
Representative Results
توضيح المنهجية التي تم إنشاؤها البيانات الوارد وصفها أعلاه، والممثل بتحليل الحمض النووي البشري من هيلا الخلايا12. الشكل 2B يبين ما يلي موجز في جميع المواقع هينسيي في الثقيلة (HS) وحبلا الخفيفة (LS) من متدنا البشرية بعد العلاج بوكل (لوحات الأيسر). حوالي 70% من 5´ الكشف عن جميع-ينتهي المعربة بالقص المواقع، مما يدل على كفاءة عالية من هضم هينسي. علاج المكتبات مع كوه يتحلل الحمض النووي في ريبونوكليوتيديس جزءا لا يتجزأ يقلل عدد القراءات في مواقع هينسيي إلى حوالي 40% (الشكل 2B، لوحات الحق). هذا من المتوقع نظراً لإعداد كبيرة من 5´-ينتهي يتم إنشاؤها في مواقع ريبونوكليوتيدي التأسيس، ويدل على نوعية المكتبة كافية. الشكل 2 يوضح التعريب والتردد 5´-الغايات (الأخضر) بعد العلاج بوكل وما يلي: إنشاء التي يتميز-seq (أرجواني) بعد العلاج كوه، كشف نهايات 5´ الحرة والغايات التي تولدها التحلل القلوية في ريبونوكليوتيديس. ينتهي 5´ الحرة وإضفاء الطابع المحلي على النظام المنسق للبشرية متدنا ribonucleotides تظهر في اللوحة اليسرى وتلك الترجمة LS تظهر في اللوحة اليسرى. الإعداد النسبية ليقرأ الخام في ريبونوكليوتيديس (الشكل 2D، اللوحة العلوية) أو مواقع هينسيي (أسفل اللوحة) على النظام المنسق و LS متدنا تظهر، على التوالي، على تغطية أقوى معدل أو 31-fold لليرة بالنسبة إلى النظام المنسق، بينما لم يلاحظ وجود تحيز مماثلة الحمض النووي. يمكن تفسير ذلك بفرق واضح في تكوين قاعدة من شقين هذا التحيز حبلا ويوضح أهمية التطبيع ليقرأ في مواقع هينسي.
تطبيع قراءة التهم ليعطي هينسي مقياس كمي لعدد ريبونوكليوتيديس كل الجينوم المتقدرية (الشكل 3A). كما هو موضح في الشكل 3 (ب)، على ما يلي بعد تطبيع كوه في المعاملة لكل ريبونوكليوتيدي لتكوين تسلسل كل حبلا إظهار نسبة مختلفة من 1، مما يشير إلى توزيع غير عشوائي من اقتراح ribonucleotide متميزة على ما يلي نمط ونوعية عالية من مكتبة. هذه النسبة لا تتأثر بالهضم السابقة مع هينسي، التحقق من الانقسام وخصوصية إنزيم. تطبيع على ما يلي في مواقع ريبونوكليوتيديس المضمنة في مواقع الانقسام هينسيي، وكذلك مضمون النوكليوتيدات الجينوم، ينشئ مقياس كمي لإدراج كم من كل ريبونوكليوتيدي كل قواعد تكميلية 1,000 ( 3 الشكل).
رقم 1: التخطيطي للحمض النووي تجهيز وإعداد مكتبة. (1) هو المشقوق الحمض النووي كل من هينسي للتطبيع في كوانتيتيشن اللاحقة من ribonucleotides، توليد نهايات حادة في مواقع هينسي (السهم الأسود). (2 الحمض النووي) يتم التعامل مع كوه يتحلل في مواقع ريبونوكليوتيدي، مما يؤدي إلى 2´، فوسفات 3´ دوري (أحمر البنتاجون) في 3´-ينتهي وتنتهي أوه 5´ الحرة. (3) ينتهي 5´--يا هي فوسفوريلاتيد من T4 بولينوكليوتيدي كيناز 3´-الفوسفاتيز-ناقص. (4) جميع الغايات 5´ تحمل مجموعة فوسفات هي متصلة إلى اليغنوكليوتيد ARC140 بالحمض النووي الريبي T4 ليجاسى. (5) الطريقة الثانية يتم تصنيعه استخدام T7 دنا بوليميريز والنوكليوتيد ARC76-77 التي تحتوي على تسلسلات6 N عشوائي. (6) مكتبة يتم تضخيمه من قبل بوليميريز الحمض النووي عالية الدقة استخدام ARC49 ومن ARC78 إلى ARC107 الإشعال الفهرس الذي يحتوي على رمز شريطي فريد للإرسال المتعدد. (7) وتقع 5´-ينتهي من إقران نهاية التسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أسلوب التحقق من الصحة- اليكتروفيروجرامس الممثل (A) التي تم إنشاؤها باستخدام نظام التفريد الآلي لتحديد النوعية إنشاء مكتبات تعامل مع إشارة كوه أو بوكل. (ب) سوماريزيد في مواقع هينسي الثقيلة (HS) وحبلا الخفيفة (LS) متدنا البشرية بعد بوكل (لوحات اليسار) أو العلاج كوه (لوحات الحق). سيركوس (ج) الرقم مجاناً 5´-الغايات (الأخضر) ومن يتميز-Seq (ينتهي 5´ الحرة و ribonucleotides، أرجواني) في النظام المنسق (اللوحة اليمنى) ومتدنا البشرية ليرة سورية (اللوحة اليمنى). تطبيع الذروة لكل القراءات مليون ويتم ضبط الذروة القصوى للحد الأقصى لعدد القراءات المكتبة يتميز seq. (د) سوماريزيد الخام يقرأ في ريبونوكليوتيديس (اللوحة العلوية) ومواقع هينسي (أسفل اللوحة) في الثقيلة (ح) والضوء (L) حبلا في متدنا البشرية (ميتو.) أو في الاتجاه المعاكس (RV) أو حبلا (مهاجم) إلى الأمام في النووي (نشاط). الحمض النووي. الأشكال ب وج ود مقتبسة من مرجع12. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نتائج الممثل. (أ) نسبة عدد ribonucleotides تطبيعها بما يلي في مواقع هينسيي للمكتبات كوه تعامل الثقيلة (ح) أو حبلا الضوء (L). (ب) نسبة الهوية ريبونوكليوتيدي لتكوين جينوم متدنا لكوة تعامل (كوه) وهينسيي المشقوق مع كوه تعامل (هينسيي + كوه) مكتبات في الثقيلة (ح) أو الخفيفة (L) حبلا من متدنا. (ج) تواتر Ribonucleotide تطبيع إلى 1,000 قواعد مكملة للتعامل مع المكتبات على الثقيلة (ح) أو حبلا الضوء (L) من متدنا هينسيي وكوه. والأرقام مقتبسة من مرجع12. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الاسم | التسلسل | |||
| ARC49 | آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكت | |||
| ARC76 | جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكتNNNN * N * N | |||
| ARC77 | أجاتكجاجاجكاكاكجتكتجاكتككاجتك * أ * ج | |||
| ARC78 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتجاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||
| ARC84 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأكاتكججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||
| ARC85 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجككتاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||
| ARC86 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتجتكاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||
| ARC87 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاكتجتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجا | |||
الجدول 1: النوكليوتيد. وترد النوكليوتيد المستخدمة لما يليها يتميز الوجه غامق يشير إلى الفهرسة. * يشير إلى سند فوسفوروثيواتي. ARC140 تحتوي على مجموعة أمينية 5´ بدلاً من مجموعة 5´--أوه، بالاقتران مع رابط C6. ويقلل هذا التعديل تشكيل كونكاتيميرس ARC140 أثناء عملية ربط.
Discussion
وهنا يقدم تقنية الخريطة وقياس ريبونوكليوتيديس في جدنا، ومتدنا على وجه الخصوص، بمقدمة بسيطة من الانقسام الحمض النووي في مواقع محددة تسلسل الجينوم كإضافة إلى البروتوكول seq يتميز المنشأة في الوقت نفسه. بينما تركز هذه الدراسة على متدنا البشرية، أصلاً وضع الأسلوب يتميز seq في Saccharomyces cerevisiae، توضح الترجمة الأسلوب إلى12،الكائنات الحية الأخرى16.
لموثوقية النتائج المتحصل عليها من هذا النهج، ينبغي الإشارة إلى بعض الخطوات الهامة: (أ) نظراً لسد محولات التسلسل لينتهي 5´ المتاحة في كل، من الأهمية بمكان للعمل مع الحمض النووي سليما جداً. الحمض النووي ينبغي أن تكون معزولة والمكتبات ينبغي أن يفضل مباشرة بعد عزل الحمض النووي، أو يمكن تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية. لا ينصح لتخزين الحمض النووي في الثلاجة لفترة طويلة أو مرارا تجميد وإذابة الجليد في ذلك. (ب) لإنشاء مكتبات مناسبة مع هذا الأسلوب، من الأهمية بمكان القيام بمعاملة كوه من الحمض النووي في فرن حضانة، بدلاً من كتلة تدفئة، وضمان تدفئة متجانسة عينة كاملة والتحلل المائي الكمي. (ج) علاوة على ذلك، من المهم مراقبة نوعية المكتبات قبل تجميع وترتيب. الحمض النووي ينبغي أن يكون كمياً وتحليلها باستخدام نظام التفريد الآلي لضمان كميات كافية من مكتبة الحمض النووي، وتأكيد الأحجام بلغة مناسبة، والتحقق من مبلمر.
لتحليل بيانات ذات مغزى، من المهم أيضا أن نلاحظ أن قيمة إعلامية من هذا الأسلوب يعتمد على ضوابط ملائمة لتقييم معلومات أساسية تهم والتحيزات القائمة على التسلسل أو حبلا. نحقق بشكل روتيني من كفاءة تعيين في عينات بوكل من ما يقرب من 70% عند هضم فقط مع اندونوكليسي تسلسل معين (الشكل 2B، لوحات الأيسر). وبالإضافة إلى ذلك، من المهم التأكد من أن معاملة اندونوكليسي لا تؤثر على مجمل الكشف عن ريبونوكليوتيديس مدمجة بمقارنة هينسي تعامل ودون علاج عينات (الشكل 3B). في هذه التجارب، قد استخدمت هينسيي لإدخال تخفيضات موقع معين، على الرغم من إنزيمات التقييد أخرى عالية الدقة يمكن أن تستخدم أيضا.
البروتوكول يمكن تكييفها وفقا لدراسة أنواع أخرى من الآفات الحمض النووي التي يمكن معالجتها بفوسفات 5´ أو 5´--أوه ينتهي. دقة النتائج تعتمد على الطابع الخاص للتجهيز ويتطلب ضوابط مناسبة (مثل نوع البرية أو غير المعالجة) للتحقق. وعلاوة على ذلك، عند تكييف هذا الأسلوب إلى تطبيقات أخرى أو لاستخدامها مع الكائنات الأخرى، ينبغي النظر أن الأسلوب في أن الإعداد الحالي يتطلب حوالي 1 ميكروغرام من الحمض النووي الذي يجري تجهيزه بمكتبة. نظراً لعدد الغايات تعتمد على عدد ريبونوكليوتيديس المضمنة، التي تختلف تبعاً للكائن أو متحولة، العينات، بما في ذلك انخفاض عدد ribonucleotides سيتطلب أكثر الإدخال الحمض النووي لتوليد عدد كاف من الغايات في بناء مكتبة اللاحقة. وبالمثل، إذا كانت عينات الحمض النووي لديها عدد أكبر من ريبونوكليوتيديس، كما سيتطلب استخدام الحمض النووي أقل الإدخال للحصول على الظروف المثلى لربط والثانية حبلا التوليف والتضخيم PCR. جدير بالذكر أن بناء المكتبة كما هو موضح في هذا البروتوكول أيضا إنشاء البيانات تغطي الجينوم النووي (كما هو معروض في الشكل 2D) وركز فقط تحليل البيانات على متدنا. وهذا يوضح أن الجينوم أكبر مع ترددات متوسطة أقل من ريبونوكليوتيدي كما يتم التقاطها بواسطة هذا الأسلوب.
وعند النظر في هذا الأسلوب، بعض القيود ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار: على الرغم من أن هذا الأسلوب، من الناحية النظرية، ينبغي تطبيقها على أي كائن حي، جينوم إشارة مناسبة ضروري للمواءمة بين ما يلي. وعلاوة على ذلك، تمثل النتائج التي تم الحصول عليها من موقعنا البروتوكول على ما يلي من عدد كبير من الخلايا. لا يمكن تحديد أنماط التأسيس ريبونوكليوتيدي محددة لمجموعة فرعية خلايا بهذا النهج. إذا كان يتم تعيين ريبونوكليوتيديس في جينومات أكبر مع عدد قليل جداً من ريبونوكليوتيديس، فإنه يمكن أن يكون تحديا لتميز ريبونوكليوتيديس من نيكس عشوائي ولذلك هناك حاجة إلى ضوابط ملائمة.
ويمتد الأسلوب يصف لنا هنا، التقنيات المتاحة في فيفو مثل Seq يتميز16أو Seq الريبوز17Seq بو18امريبوسيق19. هذه النهج الاستفادة من حساسية ribonucleotides المضمنة القلوية أو معاملة H2 رناسي، على التوالي، تستخدم تسلسل الجيل القادم لتحديد ريبونوكليوتيديس على نطاق الجينوم، الذي يسمح رسم الخرائط والمقارنة إدراج النسبي. طريق ناهضة تسلسل الحمض النووي على وجه التحديد، كما هو موضح أعلاه، بالإضافة إلى التحلل القلوية في ribonucleotides المضمنة، يمكن تطبيع على ما يلي ريبونوكليوتيديس إلى تلك المواقع الانقسام، يسمح ليس فقط بتحديد ورسم خرائط ريبونوكليوتيديس، ولكن أيضا على كوانتيتيشن لكل جزيء الحمض النووي. تطبيق لدينا التقنية في سياق الأمراض المتصلة بتكرار الحمض النووي، يمكن أن توفر إصلاح الحمض النووي، و TLS فهم أعمق لدور ريبونوكليوتيديس في الكامنة وراء الآليات الجزيئية وسلامة الجينوم بشكل عام.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
هذه الدراسة وأيده "المجلس السويدي للبحوث" (www.vr.se) ويمنح للقوس (2014-6466 و "المؤسسة السويدية" "البحوث الاستراتيجية" (www.stratresearch.se) للقوس (ICA14-0060). جامعة تشالمرز للتكنولوجيا دعما ماليا إلى مكمي أثناء هذا العمل. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| 10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
| 1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
| Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
| CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
| DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
| Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
| Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
| HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
| Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
| Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
| Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
| Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
| SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
| Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
| T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
| TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
| ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |
References
- Traut, T. W. Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines. Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).
- McElhinny, S. A. N., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).
- Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta. DNA Repair. 12, 121-127 (2013).
- Potenski, C. J., Klein, H. L. How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells. Nucleic Acids Res. 42, 10226 (2014).
- Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors. Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).
- Ghodgaonkar, M. M., et al. Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair. Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).
- DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide. Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).
- Li, Y. F., Breaker, R. R. Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group. J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).
- McElhinny, S. A. N., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).
- Berglund, A. K., et al. Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA. Plos Genet. 13, (2017).
- Brown, J. A., Suo, Z. C. Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases. Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair. Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved. Plos Genet. 7, (2011).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).
- Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat. Methods. 12, 251 (2015).
- Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq). Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).
- Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq. Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, (2009).
