Summary
Burada tarif biz aynı anda quantitate için müsait bir yöntem ve genomik DNA'ın enzimatik bölünme onun alkalin hidroliz ve sonraki 5´ uç ile birleştirerek tek nükleotid çözünürlükte son derece sağlam DNA genom geniş harita ribonucleotides sıralama.
Abstract
Ribonucleotides bir genom mevcut sayısını tahmin etmek için kurulan yaklaşımlar kısa sentetik DNA parçalarının veya plazmid şablon olarak kullanarak ve sonra bütün sonuçları extrapolating anonim ribonucleotides Nefelometri ile sınırlıdır genom. Alternatif olarak, ribonucleotides bir genom mevcut sayısı alkalin jelleri veya Güney açıkları kullanarak tahmin. Daha yeni vivo içinde yaklaşımlar pozisyon ve katıştırılmış ribonucleotides kimliğini veren ribonucleotides, genom geniş eşleme sağlayan yeni nesil sıralama istihdam. Ancak, bunlar Nefelometri genom dahil ribonucleotides sayıda izin vermez. Burada aynı anda harita ve hangi insan mitokondriyal DNA ' vivo yeni nesil sıralama tarafından Birleşmiş ribonucleotides sayısı quantitate nasıl açıklar. Biz son derece sağlam DNA kullanın ve bir endonükleaz, daha sonra hidrolize anonim ribonucleotides alkali ile ile sindirerek tarafından sıra belirli Kişilik kırılmalara tanıtmak. Oluşturulan biter bağdaştırıcılarla bakmaksızın ve bu biter bir nesil sıralama makinede sıralanamadı. Ribonucleotides kesin sayısı için sıra belirli endonükleaz tanıma sitesi okuma ortalama sayısı tanıma alanında başı dışında okuma sayısı olarak hesaplanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca harita ve ücretsiz nickler DNA'quantitate için kullanılması gereken ve işlenebilir diğer DNA lezyonlar 5´-OH için eşlemek uyum sağlar biter veya 5´-fosfat biter. Ayrıca, verilen bu uygun başvuru genom kullanılabilir herhangi bir organizma için bu yöntem uygulanabilir. Bu iletişim kuralı bu nedenle DNA ikileşmesi, 5´ uç işleme, DNA hasarı ve DNA tamir eğitim için önemli bir araç sağlar.
Introduction
Bir ökaryotik hücre, ribonucleotides (rNTPs) konsantrasyonu deoxyribonucleotides (dNTPs)1konsantrasyon yüksektir. DNA polimeraz ribonucleotides karşı ayırımcılık ama bu ayrımcılık mükemmel değildir ve sonuç olarak, ribonucleotides deoxyribonucleotides yerine genleri DNA ikileşmesi sırasında dahil. Ribonucleotides en yaygın kanonik olmayan nükleotit genom2' ye dahil olabilir. Bu ribonucleotides çoğunu RNase H2 başlatılan ribonucleotide eksizyon tamir (RER) veya topoizomeraz (başvuru3gözden geçirme) 1 Okazaki parçası olgunlaşma sırasında kaldırılır. Kaldırılamaz ribonucleotides stabil DNA2,4 ' te anonim kalmak ve (gözden geçirilmiş5' te) zararlı ve yararlı şekillerde etkileyebilir. Olumlu sinyaller olarak hareket edebilecek olmanın yanı sıra, örneğin türü çiftleşme Schizosaccharomyces pombe6 ' geçiş ve doğmakta olan DNA dizisi sırasında uyuşmazlığı işaretleme onarım (MMR)7,8, ribonucleotides etkiler ikileştirici stres ve genom istikrarsızlık11' kaynaklanan çevre DNA onların riboz10, 2´-hidroksil grubuna nedeniyle kararlılığını ve yapı9 . Genomik DNA (gDNA) ribonucleotides ve kendi alaka çoğaltma ve tamir mekanizmaları yanı sıra genom istikrar, etkileri bereket onların hassas oluşumu ve frekans bir genom geniş şekilde araştırmak için neden verir.
İnsan mitokondri içinde RNase H2 etkinlik bulunamamıştır ve ribonucleotides bu nedenle değil verimli bir şekilde mitokondrial DNA (mtDNA) kaldırılır. Çeşitli yolları insan mitokondri nükleotit arzında söz konusu ve harita ve quantitate için bir protokol geliştirdiğimiz bozuklukları mitokondrial nükleotit havuzda insan mtDNA ribonucleotides yükseltilmiş bir dizi neden olup olmadığını araştırmak için Bu ribonucleotides insan mtDNA fibroblastlar, HeLa hücreleri ve hasta hücre hatları12izole içinde.
Çoğu vitro yaklaşımlar (gözden geçirilmiş13' te DNA polimerazlar seçicilik rNTPs karşı belirlemek için) tek ribonucleotide ekleme veya astar uzantısı deneyler nerede rakip rNTPs tepki olarak dahil edilen temel alır mix, kimlik veya ribonucleotide şirketleşme göreli Nefelometri kısa DNA şablonlarında izin verme. Kısa dizileri kantitatif yaklaşımlar değil dNTP ve rNTP havuzları hücresel konsantrasyonlarda yansıtmak ve bu nedenle polimeraz seçicilik içgörü ama bütün genleri ile ilgili sınırlı önemi sağlamak. Bu bir plazmid gibi daha uzun bir DNA şablonu çoğaltma sırasında dahil ribonucleotides göreli miktarını radiolabeled dNTPs kullanarak ve bir alkali ortamın14DNA'da hidrolize bir sıralama jel üzerinde görüntülenmeyecektir gösterilmiştir. Ayrıca, gDNA alkalin hidroliz takip, strand özgü sondalama ve mutlak ribonucleotide birleşme vivo içinde15oranda belirlenmesi izin Güney açıkları analiz edilmiştir. Bu yaklaşımlar birleşme sıklığı göreli bir karşılaştırma izin ama konumunu veya anonim ribonucleotides kimliğini yok içgörü sunmak. GDNA in vivo, HydEn Seq katıştırılmış ribonucleotides16, riboz-Seq17, Pu-Seq18ya da19emRiboSeq yararlanmak gibi ribonucleotide içeriğinde analiz etmek için daha yeni yaklaşımlar duyarlılık alkali veya RNase H2 tedavi, sırasıyla ve yeni nesil sıralama ribonucleotides genom çapında tanımlamak için kullanır. Bu yöntemler algılanan ribonucleotides mutlak birleşme sıklığı içgörü sağlamak değil. Adım sıra belirli enzimatik dekolte HydEn seq iletişim kuralına ekleyerek, biz burada uygun tarif yöntemi aynı anda eşleme sağlayan bir sıralama yaklaşımdan elde edilen bilgilerden genişletir ve Nefelometri ile gömülü ribonucleotides12. Bu yöntem son derece sağlam DNA özleri oluşturulabilir ve uygun başvuru genom kullanılabilir hemen her organizma için geçerlidir. Yöntem quantitate ve bir nükleaz tarafından sindirilmiş ve 5´ fosfat veya 5´-OH sonunda bırakır herhangi bir lezyon konumunu belirlemek için adapte olabilir.
Yöntem harita ve ribonucleotides genomik DNA'quantitate için bir dizi belirli endonükleaz tarafından bölünme birleştirir ve alkali hidroliz 5´-fosfat üreten sitelerinde endonükleaz için belirli tanıma sırası yerleştirildiği ve 5´ - biter OH ribonucleotides neredeydin pozisyonlarında sona erer. Bu yana oluşturulan ücretsiz biter daha sonra bağdaştırıcılarla bakmaksızın ve yeni nesil sıralama kullanarak sıralı, son derece sağlam DNA kullanın ve DNA ekstraksiyon ve Kütüphane hazırlık sırasında rasgele parçalanma önlemek için önem taşıyor. Bu okuma endonükleaz bölünme sitelerinde okuma için normalleştirilmiş değerlendirirken bir eşzamanlı Nefelometri ve algılanan ribonucleotides eşleme sağlar. Ücretsiz 5´-biter kontrol nerede DNA alkalin hidroliz KCl ile tedavi ile değiştirilir deneylerde tespit edilir. Alınan veri ribonucleotide konum ve miktar içgörü sağlamak ve analizler ribonucleotide içerik ve birleşme sıklığı ile ilgili sağlar.
Protocol
Bu iletişim kuralı şekil 1 ' de özetlenen ve gDNA, sindirim enzimleri hidrolize alkali ile tedavi ribonucleotides, sayısı quantitate edebilmek için ile yalıtım içerir gDNA, 5´-OH ücretsiz biter fosforilasyon, ssDNA ligasyonu bağdaştırıcıları, ikinci strand sentezi ve PCR güçlendirme sıralama önce içine dahil ribonucleotides fosfodiester bağları.
1. bağdaştırıcıları ve dizin astar
- elde ARC49, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, bağdaştırıcı ve ARC78-ARC107 dizin Astar boyaları (bkz. Tablo 1).
Not: Oligonucleotides HPLC saf olmalıdır. ARC76/77 dubleks sipariş. - Hazırlamak 100 µM hisse senedi çözümler her Oligonükleotid Tris-EDTA (TE) arabelleği (Tablo reçetesi görmek) ve depolamak -20 ° C.
- ARC67/77 10 µM çözümleri ve 2 µM çözümleri ARC49 ve dizin astar, elüsyon arabellekte (EB; bkz: Malzemeler tablo) sulandrarak hazırlayın. Mağaza-20 ° C'de
2. Büyüme ve hücre hasat
- büyümek HeLa hücreleri 70 ML Dulbecco ' s modifiye kartal orta (DMEM) ile % 10 fetal sığır serum 250 mL Spinner şişesi 37 olarak takıma ° C.
- Hücreleri saymak ve 5 x 10 6 hücreler bir 50 mL tüp, santrifüj, 200 x g, 5 min için toplamak ve süpernatant atın.
- 20 mL 1 x PBS, santrifüj, 200 x g, 5 min için hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın.
- Granül-20 ° C'de dondurmak veya DNA arıtma ile devam.
3. DNA arıtma ve Nefelometri
- gDNA fenol kloroform ayıklama aşağıda açıklandığı gibi kullanarak arındırmak.
- Resuspend 2 mL lizis arabellek hücrelerde (Tablo reçetesi görmek) ve Isıtma blokta 42 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
Dikkat: Lizis arabellek tehlikeli bileşenleri içerir. SDS çözüm rahatsız edici, İndinavir K duyarlılığı, rahatsız edici ve zehirli. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek. - İki 2 mL tüpler örnekte bölünmüş ve 1 birim (V) fenol kloroform izoamil alkol (25:24:1) eklemek.
Uyarı: Toksik, mutajenik, aşındırıcı ve su ortamları için tehlikeli fenol kloroform izoamil alkol. Kullanmak bir duman başlık, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve özel fenol kloroform israf içinde atmak. - Mix inversiyon için 30-60 s ve santrifüj 15.000 x 5 min için g oda sıcaklığında.
Not: hangi sonuçları deforme rastgele kırılmalara, tanıtımı önlemek için DNA girdap mı. - 1 V fenol kloroform izoamil alkol (25:24:1) ekleyin ve yeni bir 2 mL tüp üst, sulu faz transfer.
- Mix inversiyon ve 15.000 x g 4 de 5 dk santrifüj ° C.
- Yeni bir 2 mL tüp ve 20 µL eklemek için üst, sulu faz transfer NaCl (5 M) ve 1 V / soğuk isopropanol.
Dikkat: Yanıcı, rahatsız edici ve zehirli Isopropanol. Havalandırılmış bir dolapta saklamak, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve ateş kaynaklarını hiçbir devam. - Mix INVERSION tarafından ve en az 1 h -20 için kuluçkaya ° C.
- İçin 15.000 x g, 4 ° C ve atma süpernatant, 20 dk santrifüj.
- Yıkama DNA Pelet 200 µL soğuk % 70 etanol ile 15.000 x g 4 ° c de 20 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
Dikkat: % 70 etanol yanıcı ve rahatsız edici. Çalışma çözüm-20 ° C, başka türlü mağaza havalandırılmış kabine, aşınma koruyucu giysiler ve eldiven tutmak ve ateş kaynaklarını hiçbir devam. - 20-25 dakika süreyle oda sıcaklığında DNA Pelet Makinası
- Erimesi DNA parçaları 100 µL te tampon ve bir tüp örneklerinde havuz.
- Resuspend 2 mL lizis arabellek hücrelerde (Tablo reçetesi görmek) ve Isıtma blokta 42 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
- Quantitate DNA toplama dsDNA Nefelometri reaktif üretici göre kullanarak ' s özellikleri (bkz. Tablo reçetesi).
Not: çünkü spektrofotometrik DNA Nefelometri artık fenol tarafından etkilenebilir dsDNA Nefelometri reaktif kullanın. - Mağaza DNA-20 ° c veya HincII tedavi ile devam.
4. HincII tedavi ve alkali hidroliz
- bir tepki olarak DNA'ın Özet 1 µg karışımı 5 µL 10 x arabellek 3.1, 1 µL (10 U) içeren HincII ve nükleaz ücretsiz H 2 O son hacmiyle 50 µL.
Not: tüp ligasyonu için en uygun koşulları elde etmek için ikinci strand sentez ve PCR güçlendirme, bu DNA'yı ribonucleotides çok düşük bir dizi içerir beklenen giriş DNA miktarını artırmak gerekli olabilir. Benzer şekilde, ribonucleotides sayısı çok yüksek ise giriş DNA azaltmak gerekli olabilir. - 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- HincII arındırmak tedavi DNA ile paramagnetic boncuk.
Not: kapakları granül tüpler açarak değil rahatsız etmek için aşağıdaki adımları açmak tüp tutun.- Ekleyin 1.8 V paramagnetic boncuk her örnek, dikkatle pipetting tarafından mix ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya
- Boncuk 5 min için cips daha sonra kaldırmak ve süpernatant atmak için manyetik bir raf kullanın.
- Yaklaşık 30 s sonra Kaldır ve atma süpernatant için 150 µL % 70 etanol (oda sıcaklığında) ile Pelet yıkayın.
- Yıkama Pelet ile 200 µL % 70 etanol (oda sıcaklığında) yaklaşık 30 s sonra kaldırmak ve süpernatant atın.
Not: Artık etanol 10 µL pipet ile kaldırılabilir. Damlacıkları spun aşağı kısaca önceden. - Kuru, oda sıcaklığında yaklaşık 15-20 dakika süreyle örnekleri
Not: Tam olarak ne zaman boncuk hacmi ve Pelet şeklinde bağlıdır, bu nedenle granül görsel olarak kontrol edilmelidir. - Manyetik raf tüpler kaldırın ve Pelet 45 µL EB, tarafından dikkatle pipetting mix elute.
- 5 dk sonra manyetik raf üstündeki cips ve saf DNA'ın 45 µL 4.4 adımda kullanmak için kuluçkaya.
- Ekleyin 5 µL KOH (3 M) veya KCl (3 M) toplam hacmi 50 µL oluşturma DNA için.
Dikkat: 3 M KOH aşındırıcı bir çözümdür. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek. - Incubate bir hibridizasyon 55 ° C'de 2 h için fırın buz üzerinde 5 min tarafından takip
Not: Tüp Tekdüzen bir Isıtma korumak ve kapağı, yoğunlaşma önlemek bir Isıtma blok yerine bir fırın KOH tedavi gerçekleştirmek için önerilir.
10 µL sodyum asetat ekleyerek - çökelti DNA (3 M, pH = 5,2) ve 125 µL soğuk % 100 etanol. 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya
Dikkat: % 100 etanol yanıcı ve rahatsız edici. Saklamak havalandırılmış bir dolapta, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve ateş kaynaklarını hiçbir devam. - Cips gDNA 21.000 x g, 5 min için 4 ° C de centrifuging tarafından ve süpernatant atın.
- Yıkama DNA Pelet 250 µL soğuk % 70 alkol, santrifüj kapasitesi 21.000 x g, 5 min için 4 ° C de ve süpernatant atın.
Not: damlacıkları çıkarmak, tüp aşağı kısaca tekrar döndü ve süpernatant kaldırılabilir 10 µl pipet ile. - Yaklaşık 5-10 dakika için açık bir tüp içinde görünür herhangi bir sıvı buharlaşıp vardır kadar kuru Pelet izin.
- İzin DNA Pelet erime 20 µL EB, oda sıcaklığında 30 dakika içinde.
5. 5´ son fosforilasyon
- her örnek önceden eksilerini için tepki karışımı hazırlayın2.5 µL 10 x T4 polinükleotit kinaz tepki arabellek, 1 µL (10 U) 3´ fosfataz eksi T4 polinükleotit kinaz ve 2.5 µL ATP (10 mM) isting.
- Transfer 19 µL her DNA'ın örnek bir yeni 200 µL tüp içine ve termo cycler 85 ° C'de 3 min için denatüre.
- Serin DNA örnekleri buzda ve her örnek için 6 µL tepki Mix ekleyin.
- 30 dk ve stop örnekleri 20 dk. 65 ° C'de kuluçka tarafından tepki için 37 ° C'de Incubate reaksiyon karışımları
- Arındırmak DNA olarak açıklanan 4,3, 1.8 V paramagnetic boncuk kullanarak ama 14 µL EB elute.
6. ssDNA tüp ligasyonu
- önceden 0.5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x T4 RNA ligaz tepki arabellek, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), oluşan her örnek için tepki karışımı hazırlayın 0.5 µL ARC140 (100 µM) ve %25 50 µL 8000 PEG. De pipetting tarafından Mix.
Dikkat: CoCl 3 (NH 3) 6 kanserojen, duyarlılığı ve su ortamında için tehlikeli olduğunu. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek. - Transfer 13 µL saf DNA'ın yeni bir 200 µL tüp 5.5 adım ve termo cycler 85 ° C'de 3 min için denatüre.
- Buz üzerinde DNA serin ve 36 µL pipetting tarafından mix, her örnek için tepki karışımı ekleyin ve spin aşağı kısaca.
- Her tepki için eklemek 1 µL (10 U) T4 RNA ligaz, mix pipetting tarafından ve spin aşağı kısaca.
- Örnekleri, oda sıcaklığında karanlık geceleme kuluçkaya.
7. İkinci-strand sentez
- arındırmak bakmaksızın DNA 4,3, açıklandığı gibi ama 0.8 V paramagnetic boncuk kullanın, boncuk 10 min için cips ve 20 µL EB elute.
Not: ilk Pelet adım nedeniyle daha yüksek viskozite ligasyonu tepki karışımı uzun.
DNA örneği yeni 200 µL PCR Tube - transfer 20 µL. 0.8 V paramagnetic boncuk üretici takip kullanarak arıtma adımı yineleyin ' s özellikleri ve 14 µL EB elute.
- Reaksiyon karışımı önceden 10 x T7 DNA polimeraz tepki arabellek, 2 µL 2 µL oluşan her örnek için hazırlamak ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTPs (2 mM) ve 0.8 µL BSA (1 mg/mL).
- Transfer 12,8 µL saf DNA bir yeni 200 µL tüp, termo cycler 85 ° C'de 3 min için denatüre.
- Buz üzerinde DNA serin ve her örnek, pipetting tarafından mix, spin aşağı kısaca ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya tepki karışımı 6.8 µL eklemek.
- 0.4 µL (4 U) T7 DNA polimeraz her tepki ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Arındırmak DNA olarak 4,3, açıklanan 0.8 V paramagnetic boncuk kullanarak ve 11 µL EB elute.
8. PCR güçlendirme ve Kütüphane Nefelometri
- hazırla yeni 200 her örnek için tepki karışımı µL tüp peşin 7.5 µL oluşan ARC49 (2 µM), 7.5 µL dizin astar (2 µM, her örnek için benzersiz) ve sıcak başlangıç x 25 µL 2 hazır karışım.
- Ekleyin 10 µL her tepki için DNA örneği. Aşağıdaki koşullar kullanarak kütüphane yükseltmek: 45 için 95 ° C'de denatüre 18 98 ° C devredir 15 ardından s, s, 30 65 ° C s, 30 72 ° C s, 72 ° C 2 dk. tutun örnekleri 4 ° için son bir uzama ile biten C amplifikasyon sonra.
- 0.8 V paramagnetic boncuk, kullanma 4.3 içinde açıklandığı gibi kitaplıkları arındırmak ve 20 µL TE arabellekte elute.
- DsDNA Nefelometri reaktif kullanarak kütüphaneleri üretici göre quantitate ' s özellikleri (bkz. Tablo reçetesi).
- Saklamak-20 ° C'de örnekleri ya da kitaplık analizi ile devam.
9. Kütüphane analizi ve birbirinin
- Her kitaplık kalitesini belirlemek ve bir dijital Elektroforez sistemi kullanarak ortalama parça boyutu tahmin ediyoruz.
Not: Ortalama parça boyutu nereye electropherogram eğri altındaki alan yarıya, tahmin etme tarafından değerlendirilir doruklarına gelen işaretleri göz ardı ederek. Uygun Kütüphane profilleri KOH veya KCl tedaviden sonra temsilcisi sonuçları şekil 2A verilmiştir. - Hesaplamak belgili tanımlık kütüphaneci konsantrasyonu (nM):
(c/10 3) /(p*650)] * 10 9
nerede c ng/µL kütüphanede konsantrasyon ve p kan basıncı, ortalama parça boyutu içinde tahmini 9.1. - Havuzu eşit molar miktarda 24 Kitaplıklar farklı dizin astar için sıralama ile güçlendirilmiş. 25 µL son hacmi ve konsantrasyonu 10 TE arabellek eklemek nM.
Not: havuza alınmış için kitaplıklarına sayısına bağlı olarak, her kitaplık DNA'dan miktarı ayarlanır. Astar dimer algılanırsa 9.1 yaklaşık 130 farklı bir zirve adım'bp, Kütüphane havuzu son hacmi 25 µL, çünkü arıtma adım 0.8 V paramagnetic boncuk, kullanma 4.3 içinde açıklandığı gibi tekrarlanır ve DNA 25 µL TE buf eluted aşan fer.- Belirleme dsDNA Nefelometri reaktif üretici göre kullanarak yeni kütüphane havuzu konsantrasyon ' s özellikleri ve ortalama zirve boyutu yukarıda açıklandığı gibi. Sıralama ve veri analizi (Bölüm 10 ve 11) devam.
10. Sıralama
- 75-base eşleştirilmiş uç sıralama havuza alınan kütüphaneler 12 tarihinde gerçekleştirmek.
11. veri analizi
- Trim bağdaştırıcısı dizileri, kaldırmak için tüm okuma filtre için kalite ve uzunluğu okuyun.
Not: Bu yapılabilir cutadapt 1.2.1 20 ile komutunu kullanarak ' cutadapt -f fastq--maç-okuma-joker - m 15 - q 10 - bir NNNNNNN sessiz < dosya >', nerede NNNNNNN gerçek bağdaştırıcı dizisi ile değiştirilir ve < dosya > olduğunu fastq dosya adıyla değiştirilir. - Özel komut dosyaları kullanarak önceki adımda arkadaşları, atılan bir okuma kaldırmak.
- Kalan dostum 1 hizalamak çiftleri Kütüphane hazırlanmasında kullanılan tüm oligonucleotides dizisini içeren bir dizine (papyon 0.12.8 21 ve komut satırı kullanarak Örneğin, seçenekleri - m1-v2). Tüm çiftleri ile başarılı hizalamaları atın.
- Kalan çift papyon ile komut satırını kullanarak canlı referans genomunun büyüklüğü için hizalama seçenekleri - v2 -X 10000--en iyi.
- Harita okur arasında mitokondrial molekülü başında ve sonunda o span dostum 1 tüm hizalanmamış çiftlerinin hizalayarak (papyon ile komut satırını kullanarak seçenekleri - v2).
- 5´-amaçları için tüm tek ve eşleştirilmiş son hizalamaları sayısını belirler. Bunlar bir baz akıntıya karşı tarafından konumunu nerede olduğunu hydrolyzed ribonucleotides konumuna kaydırmak. Papyon dosya
- verme verileri özel komut dosyaları kullanarak görselleştirme için ortak bir bedgraph dosya biçimine genom tarayıcılar biçimlendirin. Okuma her strand için okuma normalize milyon.
- Sayar ve pozisyon bedgraph dosyasını kullanarak başvuru Ltd.Şti kimliğini belirlemek için organizma genom dizisiorated ribonucleotides.
Not: bölgeleri 16,200-300 ve 5,747-5,847 için insan mitokondriyal genom okur için bu bölgelerdeki birçok ücretsiz 5´ biter ribonucleotide birleşme için DNA polimeraz γ tarafından ilgisiz içerdiğinden her strand çıkarılmalıdır. - Okuma okuma ribonucleotides tek iplikçik sonu, (Yani mitokondrial molekülü başına ribonucleotides sayısı) başına sayısını elde etmek için HincII site başına ortalama sayısı ile onbir HincII sitelerde hariç toplam okuma bölmek.
Representative Results
Yukarıda açıklanan, temsili veri HeLa insan mitokondriyal DNA analiz oluşturulan metodoloji gösteren12hücreleri. Şekil 2B özetlenen okuma hiç HincII siteleri ağır (HS) ve hafif iplikçik (LS) insan mtDNA KCl tedaviden sonra (sol kapı aynası) gösterir. Yaklaşık %70-in tüm algılanan 5´-uçları HincII sindirim yüksek verimliliğini gösteren kesim siteler için yerelleştirilmesine. KOH katıştırılmış ribonucleotides DNA hidrolize kitaplıklarıyla tedavi okuma sayısı yaklaşık % 40'a (şekil 2B, doğru kapı aynası) HincII sitelerdeki azalır. Bu 5´-uçları çok sayıda ribonucleotide birleşme sitelerinde oluşturulan bu yana beklenen ve yeterli bir kütüphane kalite göstergesidir. Sonra KCl tedavi ve okuma oluşturulan şekil 2C Yerelleştirme ve 5´-biter (yeşil) sıklığı HydEn-seq tarafından (macenta) KOH tedaviden sonra Ücretsiz 5´-biter ve ribonucleotides alkali hidroliz tarafından oluşturulan bitiş algılama göstermektedir. Ücretsiz 5´-biter ve insan mtDNA HS için yerelleştirme ribonucleotides sol panelinde gösterilir ve bu LS için yerelleştirme sağdaki bölmede gösterilir. Benzer bir önyargı için gözlenen değil ribonucleotides (2D rakam, üst panel) veya HincII sitelerinde (alt paneli) HS ve LS mtDNA, ham okuma göreli numaralarını, sırasıyla, LS HS, göreli bir 14-fold veya 31-fold daha güçlü kapsama gösterirken nükleer DNA. Bu strand önyargı iki iplikçiklerinin temel kompozisyon farklı farkı tarafından açıklanabilir ve okuma için normalleştirme HincII sitelerdeki önemini göstermektedir.
Okuma normalize HincII verir ribonucleotides mitokondrial genom (şekil 3A) başına sayısı niceliksel ölçüsüdür sayar. Şekil 3B' gösterildiği, KOH tedavi için her ribonucleotide her strand dizi kompozisyon için normalleştirilmiş sonra okuma bir oran 1, ayrı bir ribonucleotide düşündüren okur rasgele bir dağıtım gösteren kullanılandan farklı göstermek desen ve yüksek Kütüphane kalitesi. Bu oran HincII, enzim bölünme özgüllük doğrulama ile önceki sindirim tarafından etkilenmez. Katıştırılmış ribonucleotides bu HincII bölünme sitelerdeki yanı sıra genom nükleotit içerik sitelerinde okuma normalize kaç her ribonucleotide kişi 1000 tamamlayıcı üsleri ( dahil edilmiştir nicel bir ölçü oluşturur Şekil 3 c).
Şekil 1: DNA işleme ve Kütüphane hazırlık şematik. (1) bütün genomik DNA HincII tarafından ribonucleotides, sonraki Nefelometri normalleştirme için HincII siteleri (siyah ok ucu) künt ucunda üreten i ciddi. (2 DNA 2´, 3´-biter ve 5´-OH ücretsiz biter 3´ döngüsel fosfat (kırmızı pentagon) önde gelen, KOH ribonucleotide siteler, hidrolize ile tedavi edilir. (3) 5´-OH biter T4 polinükleotit kinaz 3´-fosfataz-eksi tarafından fosforile. (4) tüm 5´ uçları bir fosfat grubu taşıyan ARC140 Oligonükleotid T4 RNA ligaz tarafından tane. (5) ikinci strand kullanarak T7 DNA polimeraz ve rasgele N6 dizileri içeren ARC76-77 oligonucleotides sentezlenir. (6) Kütüphane ARC49 ve ARC78 ARC107 dizin astar çoğullama için benzersiz bir barkod içeren için birini kullanarak bir yüksek-sadakat DNA polimeraz tarafından güçlendirilmiş. (7) 5´-uçları eşleştirilmiş uç sıralama tarafından bulunur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: yöntemi doğrulama. (A)temsilcisi electropherograms kalitesini belirlemek için bir otomatik Elektroforez sistemi kullanılarak oluşturulan oluşturulan kitaplıkları KOH veya KCl. (B) Summarized sinyal, HincII sitelerdeki ağır (HS) ve hafif strand (LS) ile tedavi insan mtDNA KCl (sol kapı aynası) veya KOH (doğru panelleri) tedavi sonra. (C) Circos Ücretsiz 5´-biter (yeşil) ve HydEn-Seq (Ücretsiz 5´-biter ve ribonucleotides, kırmızı) HS (sol paneli) ve LS (doğru kapı aynası) insan mtDNA gelen rakam. Tepeler milyon okuma için normalleştirilmiş ve en yüksek tepe HydEn seq kütüphanesinin okuma sayısı üst sınırı için ayarlanır. Ribonucleotides (üst paneli) ve ağır (H) ve (L) ışık strand insan mtDNA (Mito.) veya ters (RV) veya ileri (FW) iplikçik nükleer (Nuc.) HincII siteleri (alt paneli), (D) Summarized ham okur DNA'SI. Rakamlar B, C ve D başvuru12den adapte olmuşlardır. Hata çubukları ortalama standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi sonuçları. (A) göreli sayısı ribonucleotides HincII sitelerde ağır (H) veya ışık (L) strand üzerinde tedavi KOH kitaplıkları için okuma için normalleştirilmiş. Ribonucleotide kimlik mtDNA genom kompozisyon KOH için (B) oranı (KOH) tedavi ve HincII tedavi KOH ile (HincII + KOH) ağır (H) veya hafif (L) iplikçik mtDNA arşivini i ciddi. (C) Ribonucleotide frekans HincII ve KOH kitaplıkları ağır (H) veya ışık (L) iplikçik mtDNA tedavi için 1.000 tamamlayıcı bazlar için normalleştirilmiş. Rakamlar referans12den adapte olmuşlardır. Hata çubukları ortalama standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adı | Sıra | |||
| ARC49 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC76 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N | |||
| ARC77 | AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C | |||
| ARC78 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC84 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC85 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC86 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC87 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA | |||
Tablo 1: Oligonucleotides. HydEn-devamı için kullanılan oligonucleotides vardır Cesur yüzünü dizin oluşturma gösterir. * bir phosphorothioate bağ gösterir. ARC140 C6 bağlayıcı ile birlikte bir 5´-OH grubu yerine bir 5´ amino grubu içerir. Bu değişiklik ARC140 concatemers oluşumu sırasında ligasyonu azaltır.
Discussion
Burada aynı anda harita ve ribonucleotides gDNA ve mtDNA özellikle, DNA dekolte, genom ek olarak oluşturulmuş HydEn seq protokol sırasını belirli sitelerdeki basit geçilmesi ölçmek için bir yöntem mevcut. Aslında bu çalışmada insan mtDNA üzerinde duruluyor olsa da, yöntemin çeviri diğer organizmaların12,16gösteren Saccharomyces cerevisiae, HydEn seq yöntemi geliştirildi.
Bu yaklaşımdan alınan güvenilir sonuçlar elde etmek için bazı önemli adımlar belirtmek gerekir: (A) tüm kullanılabilir 5´ uçları için sıralaması bağdaştırıcısı ligate bu yana, bu son derece sağlam DNA ile çalışmak çok önemli. DNA yalıtılması gerekir ve kitaplıkları tercihen hemen DNA izolasyon sonra yapılması gereken veya DNA-20 ° C'de depolanan Bu DNA buzdolabında uzun süre saklamak için veya tekrar tekrar donma ve bu yaz için tavsiye edilmez. (B) bu yöntem ile uygun kitaplıkları oluşturmak için tüm örnek ve nicel hidroliz homojen ısıtma temin bir Isıtma blok yerine bir kuluçka fırın içinde DNA'ın KOH tedavi gerçekleştirmek önemlidir. (C) Ayrıca, havuz ve sıralama önce kitaplıkları kalite kontrol için önemlidir. DNA sayısal ve Kütüphane DNA, yeterli miktarda emin olmak için bir otomatik Elektroforez sistemi kullanılarak analiz uygun parça boyutları onaylamak ve astar dimer için kontrol edin.
Anlamlı veri analizi için bu yöntemin bilgilendirici değeri arka plan sayar ve sıra veya strand önyargıları değerlendirmek için uygun denetimlere bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Biz düzenli olarak sadece sıra belirli endonükleaz (şekil 2B, sol kapı aynası) ile sindirerek zaman KCl örnekleri % 70'e yakın bir eşleme verimliliği elde. Buna ek olarak, endonükleaz tedavi genel etkilemiyor onaylamak önemlidir HincII karşılaştırarak anonim ribonucleotides tespiti tedavi ve tedavi edilmezse örnekleri (3B rakam). Diğer yüksek-sadakat enzimleri de kullanılabilir olsa bu deneylerde, biz HincII sahaya özel kesim, tanıtmak için kullandık.
Protokol adapte olabilir diğer tip-in 5´-fosfat ya da 5´-OH işlenebilir DNA lezyonlar çalışmaya biter. Sonuçlarının doğruluğunu işleme özgüllük bağlıdır ve uygun denetimler gerektirir (Örneğin, vahşi türü veya tedavi edilmemiş) doğrulaması için. Ayrıca, bu yöntem diğer uygulamalara veya diğer organizmalar ile kullanmak için adapte, biri onun geçerli kurulum yönteminde bir kitaplığı işlenen DNA'ın yaklaşık 1 µg gerektirir düşünmelisiniz. Biter sayısı katıştırılmış ribonucleotides sayısına bağımlı olduğundan, hangi örnek ribonucleotides daha düşük bir dizi dahil canlı veya mutant, bağlı olarak değişir daha DNA biter yeterli sayıda oluşturmak için giriş gerektirir Sonraki Kütüphane inşaat. DNA örnekleri ribonucleotides çok daha yüksek sayıda varsa, benzer şekilde, bu da tüp ligasyonu, ikinci strand sentezi ve PCR güçlendirme için en uygun koşulları elde etmek için daha az giriş DNA'yı kullanarak gerektirir. Bu protokol için açıklandığı gibi Kütüphane inşaat da nükleer genom ( 2D rakamgörüntülendiği gibi) kapsayan veri oluşturmak ve yalnızca veri analiz mtDNA üzerinde duruldu çekicidir. Bu orta alt ribonucleotide frekansları ile daha büyük genleri de bu yöntem tarafından yakalanır göstermektedir.
Bu yöntem dikkate alınarak, belirli sınırlamaları dikkate alınması: Bu yöntem teorik olarak, hemen her organizma için uygulanabilir olmalıdır ancak uygun başvuru genom okuma hizalama için gereklidir. Ayrıca, bizim iletişim kuralından elde edilen sonuçlar çok sayıda hücre okuma temsil eder. Belirli ribonucleotide birleşme kalıpları hücre alt grubunu bu yaklaşım tarafından tanımlanamaz. Ribonucleotides ribonucleotides çok düşük bir dizi ile daha büyük genleri eşleştirilirse, ribonucleotides gelen rasgele rumuz arasında ayırt etmek zor ve uygun denetimleri bu nedenle ihtiyaç vardır.
Biz burada, tarif yöntemi HydEn Seq16, riboz-Seq17, Pu-Seq18ya da emRiboSeq19gibi kullanılabilir vivo içinde teknikleri genişletir. Bu yaklaşımlar katıştırılmış ribonucleotides duyarlılık alkalin yararlanmak veya RNase H2 tedavi, sırasıyla, onların haritalama ve karşılaştırmasını sağlayan ribonucleotides genom genelindeki tanımlamak için yeni nesil sıralama istihdam göreli birleşme. DNA dizisi özellikle fizyon tarafından ek olarak, katıştırılmış ribonucleotides, alkali hidroliz yukarıda açıklandığı gibi ribonucleotides için okuma sadece kimlik izin ve eşleme bu bölünme siteleri için normalleştirilmiş ribonucleotides, aynı zamanda onların Nefelometri her DNA molekülü için. Bizim teknik hastalıklar bağlamında uygulama DNA ikileşmesi için ilgili DNA tamiri ve TLS moleküler mekanizmaları ve genom bütünlüğü genel olarak temel içinde ribonucleotides rolünün daha derin bir anlayış verebilir.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu çalışmada İsveç Araştırma Kurumu tarafından desteklenmiştir (www.vr.se) ARC için verir (2014-6466 ve ark (ICA14-0060) için stratejik araştırma (www.stratresearch.se) İsveçli temeli. Chalmers Teknik Üniversitesi bu çalışmaları sırasında MKME için mali destek sağladı. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| 10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
| 1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
| Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
| CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
| DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
| Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
| Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
| HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
| Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
| Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
| Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
| Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
| SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
| Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
| T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
| TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
| ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |
References
- Traut, T. W. Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines. Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).
- McElhinny, S. A. N., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).
- Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta. DNA Repair. 12, 121-127 (2013).
- Potenski, C. J., Klein, H. L. How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells. Nucleic Acids Res. 42, 10226 (2014).
- Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors. Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).
- Ghodgaonkar, M. M., et al. Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair. Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).
- DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide. Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).
- Li, Y. F., Breaker, R. R. Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group. J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).
- McElhinny, S. A. N., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).
- Berglund, A. K., et al. Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA. Plos Genet. 13, (2017).
- Brown, J. A., Suo, Z. C. Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases. Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair. Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved. Plos Genet. 7, (2011).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).
- Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat. Methods. 12, 251 (2015).
- Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq). Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).
- Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq. Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, (2009).
