生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価
Summary
乳がんのマウス ・ モデルにおける腫瘍微小環境における重要な生理学的パラメーターの評価のため水溶性次亜硝酸、トリチル プローブを用いた低磁場 (L バンド、1.2 GHz) 電子常磁性共鳴を示した。
Abstract
このプロトコルは、低磁場電子スピン共鳴 (EPR) の機能を示します-化学がん微小環境 (TME) の定量的な情報を提供するために機能の常磁性プローブとの組み合わせで技術をベースを含むpO2pH、酸化還元状態、間質性無機リン酸 (Pi) および細胞内グルタチオン (GSH) の濃度。特に、最近開発された水溶性多機能トリチル プローブのアプリケーションを提供比類のない機会を生体内での pH pO2 P同時測定Eでxtracellular スペース (希望プローブ)。プローブの分布と測定の時間の独立した相関分析の単一のプローブを使用して 3 つのパラメーターの測定を許可します。
Introduction
がんの進行と治療における TME の重要な役割はますます高く評価1です。固形腫瘍、組織低酸素症2アシドーシス3,4、高還元能力5高濃度の細胞内 GSH6、7TME の重要な生理学的パラメーターの間で間質性 Pi8はよく記載されています。非侵襲体内 pO2pH、Pi、GSH、レドックス評価は TME、生物学的過程のユニークな洞察を提供し、抗がん剤と TME をターゲットとした治療戦略の前臨床スクリーニングのための事前のツールを助けます。磁気共鳴画像 (MRI) や低磁場 EPR ベース テクニックによる組織の合理的な高周波溶込み深さはこれらの TME パラメーターの非侵襲的評価への最も適切なアプローチとなります。MRI 画像水プロトンに頼ってと解剖学的解像度を提供するために臨床の現場で広く、機能解像度を欠いています。細胞外の Pi 濃度と内因性リン酸からの信号に基づいて pH のリン 31 磁気共鳴 (31P NMR) 測定は TME 特性評価の可能性がある魅力的なが、通常数回によってマスクされ高い細胞内 Pi 濃度9,10。対照をなして、EPR 測定分光法に依存し、常磁性プローブ機能解像度を提供するために設計された特別のイメージングします。外因性の EPR プローブは外因性優位 NMR プローブ EPR の多くの高い固有の感度と内因性背景 EPR 信号の不在のため。11プローブのデュアル機能 pH および酸化還元 nitroxyl の最近の開発と、多機能トリチル プローブ12 TME のいくつかのパラメーターの同時測定体内の比類のない機会を提供します、相関解析プローブ分布と測定の時間に依存しません。私たちの知る限り、体内 pO2pHePi、還元グルタチオンなど、被験者の生活で生理学的に重要な化学 TME パラメーターを同時に評価するために使用できる他の方法がないです。
用プローブ生体内で機能の測定:
常磁性プローブ粒子および溶性プローブ TME のパラメーターにアクセスするために使用の化学構造を図 1に示します。高感度機能、安定性、生体組織と最小限の毒性は、EPR パルスオキシメータ体内の水溶性プローブ優先粒子状のプローブを作るいくつかの利点です。たとえば、粒子プローブでは、数週間にわたって組織pO2の縦断的測定を可能にする可溶性のプローブと比較して組織インプラントのサイトで保持時間を増加しています。その一方で、可溶性プローブ EPR ベース イメージングできるよう複数の機能から併用解析を用いた空間分解測定を提供することにより粒子状のプローブをアウトパ フォームする (pO2pH、Pi、酸化還元とGSH)。
図 1。TME 評価分析を組み立てる常磁性プローブの化学構造。粒子pO2プローブ、LiNc BuO 含まれます (R = O (2CH) の3CH3)、および可溶性プローブ: デュアル機能 pH および酸化還元プローブ、NR;グルタチオン (gsh) 敏感なプローブ、RSSR;多機能pO2, pH, および細胞外微小環境、希望プローブ.の Pi プローブこれらのプローブの合成は、提供された参照11,12に記載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示方法すなわちpO2pH、酸化還元状態、および間質性 Pi および細胞内 GSH 濃度化学 TME の重要なパラメーターの生体内非侵襲的評価を可能にします。MRI や低磁場 EPR などの磁気共鳴技術は、非侵襲体内のこれらの TME パラメーターのプロファイルの選択の方法です。MRI は、解剖学的構造を可視化するが、機能の感度を欠いています。MRI とは対照的 EPR 技術は微小環?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH によって部分的に支持された CA194013、CA192064、U54GM104942 を付与します。VVK, ab 級, し、TDE の立ち上げのため、WVCTSI を認めた著者は、博士・ m ・ Gencheva、k. ・ シュタインバーガーを例示実験支援ありがちましょう。内容は著者の責任と NIH の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| L-band EPR spectrometer | Magnettech, Germany | L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules | |
| Temperature & Gas Controller | Noxygen, Germany | Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition | |
| Sonicator | Fisher Scientific | ||
| GSH (L-Glutathione reduced) | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| MMTV-PyMT mice | In house | ||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Met-1 murine breast cancer cells | In house | ||
| C57Bl/6 wild type mice | Jackson Laboratory | ||
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypan Blue Exclusion Dye | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Ohmeda Fluotec 3 | |||
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott Laboratories | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic | sigma-Aldrich | S07051 | |
| Sodium Chloride | sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric acid | sigma-Aldrich | 320331 | |
| Sodium Hydroxide | sigma-Aldrich | S8045 | |
| Glucose | sigma-Aldrich | ||
| Glucose oxydase | sigma-Aldrich | ||
| Lauda Circulator E100 | Lauda-Brikmann | ||
| pH meter Orion | Thermo Scientific | ||
| LiNc-BuO probe | In house | The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13 | |
| NR probe | In house | The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11 | |
| RSSR probe | In house | The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15 | |
| HOPE probe | In house | The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12 |
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