I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment
Summary
Lav-feltet (L-band, 1,2 GHz) elektron spinn resonans med løselig nitroxyl og trityl sonder er demonstrert for vurdering av fysiologisk viktige parametere i svulst microenvironment i musen modeller av brystkreft.
Abstract
Denne protokollen demonstrerer evnen til lav-feltet elektron spinn resonans (EPR)-basert teknikker i kombinasjon med funksjonell spinn sonder å gi kvantitativ informasjon om kjemisk svulst microenvironment (TME), inkludert p O2, pH, redox status, konsentrasjoner av interstitiell uorganiske fosfat (Pi) og intracellulær glutathione (GSH). Spesielt en anvendelse av en nylig utviklet løselig multifunksjonelle trityl sonde gir uovertruffen mulighet for i vivo samtidige målinger av pH, pO2 og Pi E xtracellular plass (håper sonde). Målinger av tre parametere ved hjelp av en enkelt sonde tillate deres sammenheng analyser uavhengig sonde distribusjon og av målinger.
Introduction
En nøkkelrolle i TME i kreft progresjon og terapi er stadig mer verdsatt1. Blant viktige fysiologiske parametere av TME i solide svulster, vev hypoksi2, acidosis3,4, høy redusert kapasitet5, forhøyede konsentrasjoner intracellulær GSH6,7, og interstitiell Pi8 er godt dokumentert. Noninvasiv i vivo pO2, pH, Pi, GSH og redoks vurderinger gir unik innsikt i biologiske prosesser i TME og hjelpe forhånd verktøy for pre-klinisk screening av anti-kreft narkotika og TME-målrettet strategier. En rimelig radiofrekvens gjennomtrenging dyp vev av magnetisk resonans imaging (MRI) og lav-feltet EPR-baserte teknikker gjør dem de mest aktuelle tilnærmingene noninvasive vurdering av parameterne TME. Mr avhenger i stor grad på tenkelig vann protoner og er mye brukt i klinisk innstillinger for å gi anatomiske løsning, men mangler funksjonelle oppløsning. Fosfor-31 kjernefysiske magnetisk resonans (31P-NMR) målinger av ekstracellulære Pi konsentrasjon og pH basert på et signal fra endogene fosfat er potensielt attraktiv for TME karakterisering, men er vanligvis maskert av flere ganger høyere intracellulær Pi konsentrasjoner9,10. I motsetning til dette, EPR målinger er avhengige av spektroskopi og imaging av spesielt utformet spinn sonder å gi funksjonell løsning. Merk at eksogene EPR sonder har en fordel over eksogene NMR sonder mye høyere iboende følsomheten til EPR og fravær av endogene bakgrunn EPR signaler. Den siste utviklingen av en dobbel funksjon pH og redoks nitroxyl sondere11 og multifunksjonelle trityl sonde12 gir uovertruffen muligheter for i vivo samtidige målinger av flere TME parametere og deres korrelasjon analyser uavhengig sonde distribusjon og tidspunktet for måling. Vi vet finnes det ingen andre metoder tilgjengelig for samtidig vurdere i vivo fysiologisk viktig kjemiske TME parametere i levende emner, for eksempel pO2, pHe, Pi, redox og GSH.
Sonder for I Vivo Funksjonelle målinger:
Figur 1 viser kjemiske strukturer av spinn sonder pleide adgang TME parametere, som inkluderer partikler og løselig sonder. Høy funksjonell følsomhet, stabilitet i levende vev og minimal toksisitet er noen fordeler som gjør partikler sonder foretrukket over løselig sonder for i vivo EPR oximetry. For eksempel har partikler sonder økt tid på stedet av vev implantat sammenlignet løselig sonder gir langsgående måling av vev pO2 over flere uker. På den annen side, løselig sonder utkonkurrere partikler sonder ved å gi romlig-løst mål med EPR-baserte imaging teknikker så vel som tillater samtidig analysene fra flere funksjoner (pO2, pH, Pi, redoks og GSH).
Figur 1. Kjemiske strukturer av spinn sonder som samle TME vurdering analysen. Dette inkluderer partikler pO2 sonden, LiNc-BuO (R = – O (CH2)3lm3), og løselig sonder: dobbel funksjon pH og redoks sonde, NR; GSH-sensitive sonde, RSSR; og multifunksjonelle pO2, pH og Pi probe av den ekstracellulære microenvironment, håp sonden. Syntese av disse sonder har blitt beskrevet i de angitte referanser 11,12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene presentert tillate noninvasive i vivo vurdering av kritiske parametere av den kjemiske TME, nemlig pO2, pH, redox status og konsentrasjoner av interstitiell Pi og intracellulær GSH. Magnetisk resonans teknikker, som Mr og lav-feltet EPR, er metoder valgfrihet for noninvasive i vivo profilering av parameterne TME. Mr visualiserer anatomiske strukturer, men mangler funksjonelle følsomhet. I motsetning til Mr gi EPR teknikker funksjonelle følsomhet av lokale parameterne for …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH gir CA194013, CA192064 og U54GM104942. WVCTSI er anerkjent for oppstart VVK, AB, og TDE. Forfatterne takker Dr. M. Gencheva og K. Steinberger for hjelp med den illustrerende eksperimenter. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til NIH.
Materials
| L-band EPR spectrometer | Magnettech, Germany | L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules | |
| Temperature & Gas Controller | Noxygen, Germany | Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition | |
| Sonicator | Fisher Scientific | ||
| GSH (L-Glutathione reduced) | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| MMTV-PyMT mice | In house | ||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Met-1 murine breast cancer cells | In house | ||
| C57Bl/6 wild type mice | Jackson Laboratory | ||
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypan Blue Exclusion Dye | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Ohmeda Fluotec 3 | |||
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott Laboratories | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic | sigma-Aldrich | S07051 | |
| Sodium Chloride | sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric acid | sigma-Aldrich | 320331 | |
| Sodium Hydroxide | sigma-Aldrich | S8045 | |
| Glucose | sigma-Aldrich | ||
| Glucose oxydase | sigma-Aldrich | ||
| Lauda Circulator E100 | Lauda-Brikmann | ||
| pH meter Orion | Thermo Scientific | ||
| LiNc-BuO probe | In house | The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13 | |
| NR probe | In house | The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11 | |
| RSSR probe | In house | The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15 | |
| HOPE probe | In house | The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12 |
References
- Siemann, D. W. . Tumor Microenvironment. , (2011).
- Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
- Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
- Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
- Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
- Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
- Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
- Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
- Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
- Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
- Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
- Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
- Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
- Khramtsov, V. V., Zweier, J. L., Hicks, R. . Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , 537-566 (2010).
- Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
- Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. . Practical NMR spectroscopy. , (1980).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
- Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
- Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
- Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
- Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
- Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
- Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).
