זרימת עבודה מקיפה עבור הביטוי מטא אנליזה ATL E3 אוביקוויטין ליגאז ג'ין משפחת גפן וזיהוי הגנום כולו
Summary
מאמר זה מתאר הליך זיהוי ואפיון של משפחה ג’ין הגפן חלה על משפחתו של תודרנית Tóxicos ב Levadura (ATL) E3 אוביקוויטין ligases.
Abstract
סיווג ובמינוח של הגנים במשפחה יכול באופן משמעותי לתרום את התיאור של המגוון של מקודדים חלבונים וכדי נבואתו של פונקציות משפחתי המבוסס על מספר תכונות, כגון הנוכחות של רצף מוטיבים או במיוחד אתרים עבור שינוי post-translational והפרופיל הביטוי של בני המשפחה בתנאים שונים. עבודה זו מתאר פרוטוקול מפורט עבור ג’ין אפיון משפחה. כאן, ההליך חלה על אפיון משפחת ליגאז אוביקוויטין של E3 תודרנית Tóxicos ב Levadura (ATL) בהגפן. השיטות כוללות זיהוי ברמת הגנום של בני המשפחה, אפיון גנים לוקליזציה, מבנה, שכפול, הניתוח של חלבון שנשמרת מוטיבים, התחזית של לוקליזציה חלבון אתרי זירחון וכן ג’ין ביטוי פרופיל על פני המשפחה נתונים (datasets) שונות. הליך כזה, אשר יכול להרחיב עליו ניתוחים נוספים בהתאם למטרות ניסיוני, יכול לחול על משפחה ג’ין כל מיני צמחים אשר זמינים גנומית נתונים, והוא מספק מידע חשוב לזהות את המועמדים מעניין ללימודים פונקציונלי, נותן תובנות המנגנונים המולקולריים של הצמח ההסתגלות לסביבה שלהם.
Introduction
במהלך העשור האחרון, מחקרים רבים בהגפן גנומיקה התבצע. הגפן הוא יבול כלכלית הרלוונטיים המוכרים, אשר הפך מודל למחקר על פרי פיתוח ועל התגובות של צמחים וודי מדגיש ביוטיים, והאביוטיים. בהקשר זה, שחרורו של הגנום cv. PN40024 vinifera גפן 20071 וגירסה מעודכנת שלה 20112 הוביל הצטברות מהירה של “טכנולוגיות” סרגל נתונים וכדי פרץ של מחקרים תפוקה גבוהה. בהתבסס על הנתונים שפורסמו רצף, ניתוח מקיף של משפחה גן מסוים (בדרך כלל מורכב של חלבונים שיתוף מוטיבים שנשמרת, הדמיון המבני ו/או פונקציונלי ויחסים אבולוציונית), ניתן כעת לבצע כדי לחשוף את פונקציות מולקולרית, אבולוציה, וכן ביטוי גנים פרופילים. ניתוחים אלה יכול לתרום להבנה כיצד משפחות גנים לשלוט תהליכים פיזיולוגיים ברמת הגנום כולו.
היבטים רבים של מחזור החיים של צמחים מוסדרים על ידי בתיווך אוביקוויטין השפלה של חלבונים מפתח, אשר דורשים מחזור מכויל כדי להבטיח תהליכים תאיים רגיל. חשוב על מרכיבי התהליך בתיווך אוביקוויטין השפלה הם ligases אוביקוויטין E3, אשר אחראים על גמישות מערכת, בזכות הגיוס של מטרות מוגדרות3. בהתאם לכך, אנזימים אלה מייצגים משפחה גן ענק, עם בסביבות 1,400 E3 ליגאז קידוד הגנים לחזות את הגנום תודרנית לבנה 4, כל ליגאז אוביקוויטין E3 הוא ייצג ubiquitination של חלבונים יעד ספציפיות. למרות החשיבות של המצע ספציפי ubiquitination בתקנה התאית בצמחים, מעט מאוד ידוע על איך מוסדר השביל ubiquitination, חלבונים היעד זוהו רק במקרים מעטים. פיענוח של מנגנונים אלה ירידה לפרטים ורגולציה מסתמך קודם על זיהוי ואפיון של הרכיבים השונים של המערכת, במיוחד את ligases E3. בין ligases אוביקוויטין, תת ATL מאופיין על ידי חברי 91 ב לבנה א הצגת טבעת-H2 האצבע תחום5,6, חלקם תפקיד ההגנה, הורמון תגובות7.
הצעד הראשון מכרעת להגדרת חברי משפחה חדשה ג’ין הוא ההגדרה המדויקת של התכונות משפחה, כגון קונצנזוס במוטיבים, תחומים מרכזיים המאפיינים רצף החלבון. אכן, אמין לאחזור של כל גן בני המשפחה מבוסס על ניתוח הפיצוץ דורש מספר מאפיינים רצף חובה, בתחומים חלבון מסוים, אחראי על חלבון פונקציה/פעילות, הגשה חתימת חלבון. זה ניתן בהנחייתם של אפיון הקודם מאותה משפחה ג’ין מיני צמחים אחרים או מושגת על-ידי ניתוח גנים שונים השייכים putatively מאותה משפחה, מינים שונים כדי לבודד רצפים נפוצות. בני המשפחה ואז ניתן בנפרד בשם בעקבות כללים משותפים מיושב על ידי קונסורציומים בינלאומי עבור זן צמחים נתון. בהגפן, למשל, הליך כזה הוא נתון ההמלצות של ועדת המינוח סופר ענבים ג’ין ביאור (sNCGGa), הקמת הבנייה של עץ פילוגנטי כולל נ’ vinifera ו- לבנה א גנים בני המשפחה כדי לאפשר ג’ין ביאור בהתבסס על נוקלאוטיד רצפים8.
כרומוזום לוקליזציה של בני המשפחה וסקר שכפול גנטי לאפשר סימון הנוכחות של הגנום כולו או טנדם גנים המשוכפלת. מידע כזה מופיע שימושי לפענח פונקציות בשם ג’ין, מאז עלול להראות יתירות תפקודית או לחשוף למצבים שונים, כלומר, ללא-functionalization, ניאו-functionalization או תת functionalization9. שני ניאו – ולא משנה – functionalization הם אירועים חשובים יוצר חידוש גנטי, מתן רכיבים סלולר חדשים עבור הצמח ההסתגלות שינוי סביבות10. בפרט, כפילויות של אב קדמון גנים וייצור של גנים חדשים היו תכופים מאוד במהלך האבולוציה של הגנום הגפן, שהוקם גנים שמקורם הפרוקסימלית ואת טנדם כפילויות בהגפן היו בסבירות גבוהה יותר לייצר חדש פונקציות11.
פרופיל transcriptomic זה גורם מפתח נוסף לפענח את ג’ין תפקוד המשפחה. הזמינות של מסדי נתונים הציבור נותן גישה כמות עצומה של נתונים transcriptomic אפשר לנצל ולכן כדי להקצות פונקציות בשם ג’ין משפחתם באמצעות בקנה מידה גדול סיליקו ביטוי ניתוחים. ואכן, הביטוי המיוחד של כמה גנים באיברים צמח מסוים או בתגובה לחצים מסוימים יכול לתת כמה רמזים לגבי התפקידים בשם של החלבונים המתאים בתנאים מוגדרים, ולתת תמיכה היפותזות על האפשר functionalization המשנה של גנים המשוכפלת להגיב על אתגרים שונים. למטרה זו, חשוב לקחת בחשבון מספר נתונים (datasets): אלה יכול להיות זמין כבר גנים ביטוי מטריצות, כגון הרי האטלס הגנום כולו transcriptomic של הגפן איברים ושלבים התפתחותיים12, או יכול להיות בנוי אד הוק על ידי מאחזר datasets transcriptomic עבור המין הצמח המסויים נתון מדגיש מוגדרים. יתר על כן, בגישה פשוטה באמצעות שתי מטריצות, אחד עם נתוני הדמיון pairwise והשני עם המקדמים של pairwise ביטוי משותף ניתן להחיל כדי להעריך את קשרי הגומלין בין תבניות דמיון וביטוי רצף בתוך משפחה ג’ין.
מטרת עבודה זו היא לספק גישה גלובלית, הגדרת מבנה הגן, חלבון שנשמרת מוטיבים, מיקום כרומוזומלית, ג’ין כפילויות ותבניות הביטוי, כמו גם נבואתו של אתרי לוקליזציה, זרחון החלבון, להשיג אפיון ממצה של משפחה גנטי בצמחים. גישה כזו כוללת חל כאן אפיון משפחת ATL E3 ליגאז אוביקוויטין בבית הגפן. על פי תפקידם המתרחב של חברי תת ATL בוויסות תהליכים תאיים מפתח7, עבודה זו יכול גם לסייע הזיהוי של מועמדים ללימודים פונקציונלי, ולפצח בסופו של דבר את המנגנונים המולקולריים המסדירים הסתגלות של היבול חשוב על סביבתו.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעידן הגנומי, משפחות גנים רבים כבר שאפיינו עמוקות של מספר מיני צמחים. מידע זה הינו preliminary to מחקרים פונקציונלי ומספק מסגרת להמשיך לחקור. את התפקיד של חברים שונות במשפחה. בהקשר זה, יש גם צורך ומאפשר מערכת נומנקלטורה כדי לזהות באופן ייחודי לכל חבר במשפחה, הימנעות יתירות בבלבולים שעלולות להתעו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי האוניברסיטה של ורונה בתוך המסגרת של פרויקט משותף 2014 (אפיון משפחת הגן ATL הגפן ועל מעורבותו בהתנגדות Plasmopara viticola).
Materials
| Personal computer | |||
| Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | ||
| Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) | http://www.megasoftware.net/ | ||
| Motif-based sequence analysis tools (MEME) | http://meme-suite.org/ | ||
| Geneious | Biomatters Limited | http://www.geneious.com/ | |
| ProtParam Tool | http://web.expasy.org/protparam/ | ||
| ngLOC | http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html | ||
| TargetP v1.1 Server | http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ | ||
| Protein Prowler | http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/ | ||
| MUsite | http://musite.sourceforge.net/ | ||
| Pfam | http://pfam.xfam.org/ | ||
| TMHMM Server v. 2.0 | http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ | ||
| ProtScale | http://web.expasy.org/protscale/ | ||
| Grape Genome Database (CRIBI) | http://genomes.cribi.unipd.it/grape/ | ||
| PhenoGram | http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot | ||
| MCScanX | http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/ | ||
| Interactive Tree Of Life (iTOL) | http://itol.embl.de/ | ||
| UniProt | http://www.uniprot.org/ | ||
| Phylogeny.fr | http://www.phylogeny.fr/index.cgi | ||
| MUSCLE | http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ | ||
| Gblocks Server | http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html | ||
| Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix | https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_datamatrix_geneIDs_Fasoli2012 | ||
| Multi Experiment Viewer (MeV) | http://mev.tm4.org/#/welcome | ||
| Sequence Read Archive (SRA) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra | ||
| R | https://www.r-project.org/ | ||
| EMBOSS Needle (EMBL-EBI) | http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ |
References
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Adam-Blondon, A. -. F., et al. . Genetics, Genomics, and Breeding of Grapes. , 211-234 (2011).
- Chen, L., Hellmann, H. Plant E3 Ligases: Flexible Enzymes in a Sessile World. Mol. Plant. 6 (5), 1388-1404 (2013).
- Vierstra, R. D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 385-397 (2009).
- Serrano, M., Parra, S., Alcaraz, L. D., Guzmán, P. The ATL Gene Family from Arabidopsis thaliana and Oryza sativa Comprises a Large Number of Putative Ubiquitin Ligases of the RING-H2 Type. J. Mol. Evol. 62 (4), 434-445 (2006).
- Aguilar-Hernández, V., Aguilar-Henonin, L., Guzmán, P. Diversity in the Architecture of ATLs, a Family of Plant Ubiquitin-Ligases, Leads to Recognition and Targeting of Substrates in Different Cellular Environments. PLoS One. 6 (8), e23934 (2011).
- Guzmán, P. The prolific ATL family of RING-H2 ubiquitin ligases. Plant Signal Behav. 7 (8), 1014-1021 (2012).
- Grimplet, J., et al. The grapevine gene nomenclature system. BMC Genomics. 15, 1077 (2014).
- Prince, V. E., Pickett, F. B. Splitting pairs: the diverging fates of duplicated genes. Nat. Rev. Genet. 3 (11), 827-837 (2002).
- Magadum, S., Nerjee, U., Murugan, P., Gangapur, D., Ravikesavan, R. Gene duplication as a major force in evolution. J. Gen. 92 (1), 155-161 (2013).
- Wang, N. Patterns of Gene Duplication and Their Contribution to Expansion of Gene Families in Grapevine. Plant Mol. Biol. Rep. 31 (4), 852-861 (2013).
- Fasoli, M. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- . BLAST2.6.0 Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2016)
- . Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas Available from: https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_datamatrix_geneIDs_Fasoli2012 (2015)
- . Sequence Read Archive (SRA) Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra (2017)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq-a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- . Version 3.4.1 Available from: https://www.r-project.org/ (2017)
- Ritchie, M. E. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43 (7), e47 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Ariani, P. Genome-wide characterisation and expression profile of the grapevine ATL ubiquitin ligase family reveal biotic and abiotic stress-responsive and development-related members. Sci. Rep. 6, 38260 (2016).
- Vitulo, N., et al. A deep survey of alternative splicing in grape reveals changes in the splicing machinery related to tissue, stress condition and genotype. BMC Plant Biol. 14 (1), 99 (2014).
- Overbeek, R., Fonstein, M., D’Souza, M., Pusch, G. D., Maltsev, N. The use of gene clusters to infer functional coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (6), 2896-2901 (1999).
- Dalquen, D. A., Dessimoz, C. Bidirectional Best Hits Miss Many Orthologs in Duplication-Rich Clades such as Plants and Animals. Genome Biol. Evol. 5 (10), 1800-1806 (2013).
- Remm, M., Storm, C. E. V., Sonnhammer, E. L. L. Automatic clustering of orthologs and in-paralogs from pairwise species comparisons1. J. Mol. Biol. 314 (5), 1041-1052 (2001).
- Kaduk, M., Sonnhammer, E. Improved orthology inference with Hieranoid 2. Bioinformatics. 33 (8), (2017).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 370 (2014).
- Juretic, N., Hoen, D. R., Huynh, M. L., Harrison, P. M., Bureau, T. E. The evolutionary fate of MULE-mediated duplications of host gene fragments in rice. Genome Res. 15 (9), 1292-1297 (2005).
- Filichkin, S. A. Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana. Genome Res. 20 (1), 45-58 (2010).
- Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
- Wong, D. C. J., Gutierrez, R. L., Gambetta, G. A., Castellarin, S. D. Genome-wide analysis of cis-regulatory element structure and discovery of motif-driven gene co-expression networks in grapevine. DNA Res. 24 (3), 311-326 (2017).
- Wong, D. C. J., Matus, J. T. Constructing Integrated Networks for Identifying New Secondary Metabolic Pathway Regulators in Grapevine: Recent Applications and Future Opportunities. Front. Plant Sci. 8, 505 (2017).
