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Abstract
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발생학

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

Published: March 02, 2018
doi:
10.3791/56628
, , , , , , , , ,
1Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics,Rutgers University

Summary

Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.

Abstract

인간의 두뇌 개발 초기 단계 확산, 마이그레이션 및 neurite 결과; 고유와 정확 하 게 조율 된 프로세스의 시리즈를 통해 진행 그리고 후기 축 삭/모 수석 파생물 및 시 냅 스 형성에 의해 특징. neurodevelopmental 장애, 종종 이러한 프로세스 중 하나 이상을 교란, 두뇌 형성과 기능에 이상이 선도. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기술의 출현, 연구원은 지금 뉴런을 포함 한 거의 모든 세포 유형으로 분화 될 수 있다 인간 세포의 풍부한 공급이 있다. 이 세포는 정상적인 두뇌 개발 및 질병의 병 인 연구에 사용할 수 있습니다. HiPSCs 말기 정신병 질환 사용 모델을 사용 하 여 프로토콜 수 분화 신경 또는 3D 문화 시스템을 사용 되 나 organoids. 이러한 방법은 인간의 질병 병 인 공부에 귀중 한 입증 했다, 몇 가지 단점이 있습니다. HiPSCs 신경 세포로의 분화 및 organoids의 생성 하는 실험 및 평가 될 수 있는 변수의 수에 영향을 미칠 수 있는 긴 하 고 비용이 많이 드는 프로세스. 또한, 포스트 mitotic 신경 및 organoids 질병 관련 프로세스, 모 수석 파생물, synaptogenesis, 등의 연구를 허용 하는 동안 그들은 확산 및 마이그레이션 같은 이전 프로세스의 연구를 배제. Neurodevelopmental 장애, 자폐증, 등에서 풍부한 유전과 사후 증거는 초기 발달 과정에서 결함을 나타냅니다. 신경 선구자 세포 (Npc), 높은 증식 세포 인구 ontogenetic 프로세스 및 질병 개시에 대 한 질문에 적합 한 모델을 수 있습니다. 우리는 지금 인간 Npc에 마우스와 쥐 대뇌 피 질의 문화에서 개발 공부에서 배운 방법론을 확장 합니다. NPCs의 사용 우리가 질병 관련 고기를 조사 하 고 어떻게 다른 변수 (예를 들어, 성장 요인, 마약) 충격 발달 과정 등 확산, 마이그레이션, 차별화 몇 일만에 정의할 수 있습니다. 궁극적으로,이 도구 집합 질병 특정 메커니즘 및 neurodevelopmental 장애에 고기 식별 하 재현성 및 높은 처리량 방식으로 사용할 수 있습니다.

Introduction

간단한 유기 체와 마우스 모델을 사용 하 여 기본 두뇌 개발 질병 pathogenesis의 메커니즘을 해명 했습니다. 이러한 발전에도 불구 하 고 많은 정신병 무질서의 병 인 간단한 유기 체에 있는 모든 발견은 인간 질병의 복잡 한 측면에 직접 관련이 있기 때문에 애매 남아 있습니다. 또한, 인간의 두뇌의 더 복잡 종종 모델 인간 개발을 어렵게 하 고 동물에 장애. 진화와 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 기술의 진보와 함께 체세포 줄기 세포로 재설정 고 인간의 질병을 연구 하는 신경 세포로 분화 될 수 있습니다. (유전체학, transcriptomics, proteomics, metabolomics) hiPSCs 및 “omic” 기술의 발전 인간 두뇌 개발의 이해에 혁명을 약속 드립니다. 이러한 기술은 지금 가능 하 게 “정밀 의학” 접근에 사건-의해-사건을 기준으로 정신병 질환의 특성에.

HiPSC 질병-모델링 분야에서 현재 주식은 특정 신경 하위는 단층으로 세포 분화 하거나 두뇌 개발1,2,의 측면을 정리 하는 organoid 라는 3D 문화 시스템을 사용 하 3. 이러한 시스템은 엄청나게 공부 하 고 인간의 개발 및 질병4,5,,67의 독특한 측면을 잠복 근무에 귀중 한 되었습니다. 그러나, 신경 문화와 organoids 종종 필요 어디서 나 주에서 문화에서 개월 공부 준비가 되기 전에. 이러한 프로토콜의 이러한 문화 시스템 자주 수행 될 수 있는 실험의 수 및 테스트할 수 있는 성장 요인 또는 (마약) 처럼 변수 수 제한 유지 하는 데 필요한 리소스의 양을 소모 자연. 또한, 포스트 mitotic 신경 및 organoids를 이용 하 여 많은 연구 개발에서 나중에 발생 하는 모 수석 파생물 또는 시 냅 스 형성, 등의 프로세스에 집중 했다. 이러한 프로세스 발달 장애 자폐증과 정신 분열 증 등의 병 리에 연루 되어, 이전 확실 한 신경 분화 하기 전에 발생 하는 개발 이벤트는 질병 병 인8에 대 한 중요 한 ,,910,11,,1213. 실제로, 최근 게놈 연구 보여줍니다 확산, 프로세스 파생물 및 마이그레이션 구성 되어, 중반에 태아 기간 자폐증 pathogenesis11,14에서 특히 중요 하다. 따라서, 신경 줄기와 조상 세포 인구 이러한 이전 프로세스를 보다 잘 이해 하려면 공부 하는 것이 중요 하다. Organoid 시스템을 더 나은 간주 정리 인간의 두뇌 개발 3D 자연 조직된 구조 때문에, 이러한 이전 이벤트의 일부 연구 활용 되어 조상 수영장을 포함지 않습니다. 그러나, organoids에 조상 인구 종종 스파스 이며 신경 줄기 또는 조상 세포5,15보다 광선 glial 세포 처럼. 따라서, 그것은 neurodevelopment 적극적으로 증식 세포 인구에서의 초기 단계를 공부 하는 높은 처리량 방법을 도움이 될 것 이다.

연구실에서 우리 hiPSC 파생 신경 선구자 세포 (Npc), 높은 증식, 확산, 세포 이동 등 neurodevelopmental 프로세스를 연구 하는 신경 줄기와 조상 세포의 혼합된 인구를 사용 하는 프로토콜을 만들었습니다 그리고 초기 프로세스 (neurite) 확장입니다. 이 분석 실험은 성공적으로 쥐와 쥐 대뇌 피 질의 문화16,17,,1819,20, neurodevelopment 공부를 수십 년 동안 우리가 실험실에서 사용 되는 기술에서 개발 되었다 21,,2223. 중요 한 것은, 그것은 또한 고기 및 쥐 및 마우스 문화 시스템에 정의 된 규정 신호는 매우 활성 vivo에서, 이러한 기술을16, 의 값을 나타내는 메커니즘의 예측 표시 했다 17,18,,1924. NPCs에 hiPSCs의 초기 분화 후 이러한 방법을 수 일의 문제에 중요 한 발달 과정을 연구. 이러한 방법에는 많은 이점이 있다: (1) 그들은 약간 정교한 장비가 필요 하 고 구현 하기 쉬운, (2) 수많은 실험적인 복제 시간, 결과, 그리고 (3)의 재현성의 빠른 확인을 위해 수 있도록 짧은 기간에 지휘 될 수 있다 신속 하 고 비용 효율적으로 코팅 행렬, 성장 요인의 효과 약물의 활동 문화 변수를 테스트할 수 있습니다. 또한, 우리 확고 역할 extracellular 성장 요인의 다양 한 개발 프로세스의 중요 한 레 귤 레이 터의 활용. NPCs는 직접 확산, neurite 결과, 및 셀 마이그레이션 같은 이벤트를 자극 하 고 그들은 제어 조건19 에 명백한 되지 않은 결함을 식별 하는 기능을 강화 하는 것을 발견 했다 발달 신호 선택에 노출 됐다 , 25 , 26 , 27 , 28. 마찬가지로, 약물 평가의 용이성 제공 다양 한 치료 적 개입의 효율성을 테스트할 정밀 의학 기술을 채택 하는 강력한 애비뉴. 따라서,이 프로토콜은 재현성, 높은 처리량 및 초기 두뇌 발달, 질병의 병 인, neurodevelopmental 고기에 성장 요인 및 약물의 잠재적인 유익한 효과 공부 하 고 간단한 방법론을 촉진 한다.

Protocol

1. 안전 절차 및 Biosafety 내각 유지 보수 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 안전 절차 BSL-2 재료 작업에 기관의 지침에 따라. 기관의 관행에 따라 BSL-2 자료는 삭제 합니다. 객실과 BSL-2 재료에 사용 되는 장비를 나타냅니다. 모든 개인 보호 장비 (PPE), 실험실 코트와 장갑 등을 착용 합니다. Biosafety 내각 유지 보수 Biosafety 내각 BSL-2 레벨 재료의 사용?…

Representative Results

이러한 연구의 한 목표 Npc, 즉, 셀 숫자 증가의 증식 활동을 정의 하는. 이것은 전체 세포 인구 세포 추출 물에 방사성 추적 tritiated 티 미 딘의 설립이 고 그들이 인지 S 단계에 종사 하는 모든 셀을 반영 하는 높은 처리량 접근 방식의 DNA 합성을 평가 함으로써 얻을 수 5 분 또는 전체 2 시간에 대 한 합성. 또한, 이러한 분석 실험 S-위상 및 총 세포 숫자, 단일 셀의 더 노동 집?…

Discussion

여기에 제시 된 프로토콜 기본 neurodevelopmental 프로세스를 연구 하 고 성장 인자와 약물 hiPSC 파생 신경 선구자 세포를 사용 하 여 테스트를 신속 하 고 간단한 방법을 설명 합니다. hiPSC 기술 사는 영향을 받는 개인에서 인간의 신경 세포를 전례 없는 접근 제공 하 여 neurodevelopmental 질병의 병 인 연구를 혁명을 했다. 실제로, 레트 증후군, 티 모 증후군, 연약한 X 증후군을 포함 한 neurodevelopmental 장애의…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 의료 연구 및 치료의 자폐증 (CAUT13APS010;에 대 한 뉴저지 주지사의 위원회에 의해 지원 되었다 CAUT14APL031; CAUT15APL041), 낸시 Lurie 표시 Mindworks 자선 리드 신뢰, 가족 재단과 큰 보스턴과 뉴저지의 유태인 공동체 기초.

Materials

PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide
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References

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Neural Precursor CellsNeurodevelopmental PhenotypesNeural DevelopmentCell CharacterizationCell CultureCell DetachmentCell HarvestingTritiated ThymidineCell ProliferationNeurodevelopmental DisordersNeuropsychiatric DisordersRapid And Reproducible Method

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Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).
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