Этот протокол описывает новый метод для исследования формы химической нейростимуляция wholemount крыса сетчатки в пробирке с нейромедиатора глутамата. Химические нейростимуляция является перспективной альтернативой обычных электронейростимуляция нейронов сетчатки для лечения необратимой слепоте, вызванные фоторецепторных дегенеративных заболеваний.
Фоторецептор дегенеративные заболевания вызывают непоправимый слепоты через прогрессивные потерю фоторецепторных клеток в сетчатке. Сетчатки протезы являются возникающих лечения фоторецепторных дегенеративных заболеваний, которые стремятся восстановить зрение, искусственно стимулируя сохранившихся нейронов сетчатки в надежде вызывая понятную визуального восприятия больных. Текущий сетчатки протезы продемонстрировали успех в деле восстановления ограниченное видение для пациентов с помощью массива электродов для электрически стимулировать сетчатки, но сталкиваются значительные физические барьеры в восстановлении высокая острота, природные зрение пациентам. Химические нейростимуляция, используя родной нейротрансмиттеров является альтернативой электрические стимуляции биоимитирующие и может обойти основные ограничения, связанные с сетчатки протезов с помощью электронейростимуляция. В частности химические нейростимуляция имеет потенциал, чтобы восстановить более естественным зрение с сопоставимым или более visual acuities для пациентов путем инъекций очень небольших количествах нейротрансмиттеров, же естественными агентами связи, используемых сетчатки химические синапсы, гораздо тоньше разрешением, чем текущий электрические протезы. Однако как сравнительно неизученными стимуляции парадигмы, существует нет протокол для достижения химической стимуляция сетчатки в пробирке. Целью этой работы является предоставить подробные рамки для выполнения химической стимуляция сетчатки для следователей, которые желают изучить потенциал химического neuromodulation сетчатки или аналогичных нервных тканей в пробирке. В этой работе мы описываем экспериментальной установки и методологии для выявления сетчатки ганглия клеток (РЦ) Спайк ответов похож на визуальные легкие ответы в одичал тип и фоторецепторных выродились wholemount сетчатки крыс путем инъекций контролируемых объемов нейромедиатора глутамата в субретинальное пространство с помощью micropipettes стекла и пользовательских многопортовые microfluidic устройство. Эта методология и протокол являются достаточно общими, чтобы быть адаптирована для neuromodulation с помощью других нейротрансмиттеров или даже другие нервные ткани.
Фоторецептор дегенеративных заболеваний, таких как пигментный ретинит и age-related macular вырождения, являются ведущими наследуемые причины потери зрения и в настоящее время неизлечимых1,2. Хотя эти болезни возникают из целого ряда специфических генетических мутаций, фоторецепторных дегенеративные заболевания как группы характеризуются постепенной потери фоторецепторных клеток в сетчатке глаза, которые в конечном итоге приводит к слепоте. Потерю фоторецепторных клеток триггеров широко реконструкции всей сетчатке, но выжившие сетчатки нейронов, в том числе биполярное клетки и РГК, остаются неповрежденными и относительно функциональных даже на продвинутых стадиях фоторецепторных дегенерации3 ,4,5,6,7.
Механизмы и патологии этих заболеваний были хорошо характеризуется3,4,5,6,7 , но эффективным средством лечения остается труднодостижимой. За последние три десятилетия во всем мире Ученые исследовали различные терапевтические процедуры для восстановления зрения тем, кто пострадал с фоторецепторных дегенеративных заболеваний, включая генной терапии8, стволовых клеток лечение9, сетчатки трансплантация10и11,искусственной стимуляции12 сохранившихся нейронов сетчатки. Из них наиболее клинически доступны сетчатки протезы, которые являются искусственные нейростимуляция устройств, которые традиционно использовали массив Электроды электрически стимулировать биполярных клеток или РГК в конкретных моделей с целью Создание искусственных визуального восприятия в11пациентов. Нынешнее поколение электрических протезы, например Argus II13 и14 устройств альфа-IMS, достигли клинический утверждения и предварительные исследования показали, что они могут улучшить качество жизни пациентов путем восстановления мера видения с помощью epiretinal (передней части сетчатки) и subretinal (задней части сетчатки) имплантированных устройств,1516. Исследовательские группы во всем мире работают на продвижении сетчатки протезы за успехи этих первого поколения устройств17,18,19,20 , но столкнулись с трудности, проектирование электрических протез, способный восстановление высокая острота зрения ниже уровня правовой слепоты для пациентов. Недавние исследования показали, что достижение более высоким пространственным разрешением чем включаемые нынешнего поколения на основе электрических протезов является сложной задачей из-за ограничения впрыска заряд, который требует использования большого электродов безопасно стимулировать нейроны сетчатки ценой пространственное разрешение, т.е. острота11,21. Кроме того, электрической стимуляции еще ограниченный, поскольку он обычно стимулирует все близлежащие клетки и поэтому вызывает неестественно и запутанной восприятия больных, главным образом потому, что это по сути противоестественно стимуляции парадигма21. Тем не менее первые успехи электрической стимуляции продемонстрировали, что искусственные нейростимуляция может быть эффективным средством лечения дегенеративных заболеваний фоторецептор. Это позволяет предположить, что даже более эффективным средством лечения может быть достижимыми, стимулируя сетчатки с нейромедиатором химических веществ, природные агенты коммуникации на химические синапсы. Цель метода, представленных в настоящем документе заключается в изучении терапевтические возможности химического стимуляции, который пытается имитировать природные системы синаптической связи между сетчатки нейронов, как альтернатива электрическим стимуляции биоимитирующие для сетчатки протез.
Перевод концепции терапевтической химической стимуляции к химической протез сетчатки опирается на химически активации целевой сетчатки нейронов с небольшим количеством родной нейротрансмиттеров, например глутамата, выпустили через microfluidic устройство состоит из большой массив microports в ответ на визуальной стимуляции. Таким образом химический протез сетчатки по существу бы biomimetic искусственных фоторецепторных слой, который переводит фотонов, естественно достигает сетчатки химические сигналы. Так как эти химические сигналы используют же нейротрансмиттеров, используемых в обычных сетчатки сигнализации и стимулировать сохранившихся сетчатки нейронов выродились сетчатки через же синаптических пути, используемые пути нормальное зрение, результате visual восприятие, достигнуто путем химического протез сетчатки может быть более естественным и понятным по сравнению с одним вызвали через электрические протеза. Кроме того, поскольку microports, через которые выпускаются нейротрансмиттеров могут быть сделаны очень маленькие и выстроились в высокой плотности, в отличие от электродов, потенциальных химических протезов может быть способны достичь больше фокуса стимуляции и выше пространственных разрешение, чем электрические протеза. Таким образом основываясь на эти потенциальные преимущества, химическая протез сетчатки предлагает весьма перспективной альтернативой электрические протезы.
Химические стимуляция сетчатки, однако, сравнительно мало исследована до недавнего времени. В то время как электрическая стимуляция сетчатки хорошо характеризуется течение десятилетий работы в пробирке22,23, в естественных условиях23,24и клинических исследований13 ,14, исследования по химическим стимуляции были ограничены исключительно несколько в vitro работ25,26,27,28. Iezzi и Финлейсон26 и Инайат и др. 27 продемонстрировал epiretinal химических стимуляция сетчатки в пробирке с помощью одного электрода и массив многоэлектродный (MEA), соответственно, для записи глутамата вызывали ответов нейронов сетчатки. Совсем недавно, Рантри и др. 28 продемонстрировал дифференциального стимуляции и выключения сетчатки путей, с помощью глутамата из стороны субретинальное и МПС для записи нейронных ответов от нескольких сайтов на сетчатке.Хотя эти работы предварительно создали возможности химического стимуляции, необходимы дальнейшие исследования расследовать многие аспекты этого подхода, помимо тех, которые пока рассмотрены25,,2627 , 28и тонкой настройки параметров терапевтического стимуляции в моделях животных и in vitro и in vivo до воплощения этой концепции к химической протез сетчатки как обсуждалось выше. Однако в настоящее время существует установившейся методологии для выполнения химической стимуляция сетчатки в литературе и методы, используемые в предыдущих работах не были описаны в таких деталях как бы важное значение для репликативной исследований. Таким образом основания для этого методы бумага является предоставить четкие рамки для проведения в vitro химических стимуляция сетчатки для этих следователей интересует либо репликация наших предыдущих исследований27, 28 или дальнейшего продвижения этой нарождающейся концепции химических нейростимуляция.
Здесь мы показываем метод для проведения в vitro химических стимуляция сетчатки нейронов в wholemount сетчатки крыс одичал тип и фоторецепторных выродились крысы модель, которая тесно имитирует прогрессирование дегенеративных фоторецепторных заболевания в организме человека. В разработке этого метода стимуляции в vitro моделей лежит оценить терапевтический диапазон различных параметров стимуляции и изучения нейронных ответ характеристики, которые было бы невозможно или сложно наблюдать в в VIVO моделей, особенно в ходе первоначального исследования сосредоточены на оценке целесообразности этого подхода. В этой процедуре мы покажем как одного сайта, так и одновременного многосайтовой химических стимуляцию сетчатки путем предоставления небольших количествах 1 мм глутамата вблизи целевой сетчатки нейронов через коммерчески доступных однопортовый стекла micropipettes и пользовательского micromachined microfluidic многопортовые устройства, соответственно. Хотя одного сайта и многосайтовой стимуляцию достичь основной цели расследования терапевтические возможности химических neuromodulation, каждая служит собственный с уникальным преимуществом. Стимуляции одного сайта, который может быть достигнуто с коммерчески доступных предварительно вытащил стекла micropipettes, может использоваться для вставки химических веществ непосредственно в недрах сетчатки на одном сайте и служит для расследования, если наблюдаемый RGC всплеска ставка ответы, которые похожи на визуально вызвала легких ответов можно централизовано вызвали в месте инъекции. С другой стороны, Мульти сайт стимуляции, который требует специально сфабрикованы microfluidic многопортовые устройства, может использоваться для вставки химических веществ пространственно на нескольких сайтах на поверхности сетчатки и служит расследовать как хорошо глутамата вызывали RCG ответ шаблоны соответствуют закономерности инъекции глутамата в шаблон стимуляции исследований.
Метод, представленные здесь, демонстрирует уникальный нейронной стимуляции парадигма, в которой нейроны сетчатки химически стимулируются путем впрыскивать родной нейромедиатора химических веществ в недрах сетчатки в пробирке. Этот метод химического стимуляции предлагает неск?…
The authors have nothing to disclose.
Работы, представленные в документе был поддержан национального научного фонда, новые рубежи в области научных исследований и инноваций (NSF-EFRI) программа предоставить номер 0938072. Содержание этого документа являются исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NSF. Авторы также хотел бы поблагодарить д-ра Samsoon Инаятом за его работу, проектирование и тестирование начальной экспериментальной установки для химической стимуляции и г-н Ashwin Raghunathan за его работу, проектирования, изготовления и оценки microfluidic многопортовое устройство, используемое в Это исследование.
Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1_HAUK_ProductDetail |
Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |