Det här protokollet beskriver en ny metod för att utreda en form av kemiska neurostimulering av wholemount råtta näthinnor i vitro med signalsubstansen glutamat. Kemiska neurostimulering är ett lovande alternativ till den konventionella elektriska neurostimulering av retinala nervceller för behandling av irreversibel blindhet orsakad av ljusmätare degenerativa sjukdomar.
Ljusmätare degenerativa sjukdomar orsaka obotlig blindhet genom progressiv förlust av ljusmätare celler i näthinnan. Retinal proteser är en framväxande behandling för ljusmätare degenerativa sjukdomar som syftar till att återställa vision genom att artificiellt stimulera de överlevande retinala nervcellerna i hopp om att framkalla begripliga visuell perception hos patienter. Nuvarande retinal proteser har visat framgång i att återställa begränsad vision till patienter som använder en matris av elektroder att elektriskt stimulera näthinnan men möter betydande fysiska hinder i att återställa hög skärpa, naturlig vision till patienter. Kemiska neurostimulering använder infödda signalsubstanser är en biomimetiska alternativ till elektrisk stimulering och kunde förbifartsleden de grundläggande begränsningar som är associerad med retinal proteser med elektriska neurostimulering. Specifikt, har kemiska neurostimulering potential att återställa naturligare vision med jämförbara eller bättre visual pressauppförandet till patienter genom att injicera mycket små mängder signalsubstanser, samma naturliga agenter för kommunikation som används av retinal kemiska synapser, på mycket finare upplösning än nuvarande elektriska proteser. Dock som en relativt outforskat stimulering paradigm finns det inget etablerat protokoll för att uppnå kemisk stimulering av näthinnan i vitro. Syftet med detta arbete är att ge en detaljerad ram för fullbordande av kemisk stimulering av näthinnan för utredare som vill studera den potentiella av kemiska neuromodulation av näthinnan eller liknande neurala vävnader in vitro. I detta arbete, vi beskriver experiment och metodik för framkalla retinal ganglion cell (RGC) spike Svaren liknar visual ljus svaren i vildtyp och ljusmätare-degenererade wholemount råtta näthinnor genom att injicera kontrollerade mängder signalsubstansen glutamat i subretinalområdet använda glas Mikropipetter och en anpassad multiport mikroflödessystem enhet. Denna metodik och protokollet är tillräckligt allmänna för att anpassas för neuromodulation använder andra signalsubstanser eller även andra neurala vävnader.
Ljusmätare degenerativa sjukdomar, såsom retinitis pigmentosa och åldersrelaterad makuladegeneration, är ledande ärftliga orsakerna till synnedsättning och är för närvarande obotliga1,2. Även om dessa sjukdomar uppstår från en mängd specifika genetiska mutationer, karakteriseras ljusmätare degenerativa sjukdomar som en grupp av progressiv förlust av ljusmätare celler i näthinnan, vilket så småningom orsakar blindhet. Förlusten av fotoreceptorer utlösare utbredd remodeling hela näthinnan men överleva retinala nervceller, inklusive bipolära celler och RGCs, förbli intakt och relativt funktionella även i avancerade stadier av ljusmätare degeneration3 ,4,5,6,7.
Mekanismerna och patologier av dessa sjukdomar har varit väl karakteriserade3,4,5,6,7 men en effektiv behandling förblir svårfångade. Under de senaste tre decennierna, har forskare i hela världen undersökt en mängd olika terapeutiska behandlingar för att återställa vision till de drabbade med ljusmätare degenerativa sjukdomar inklusive gen terapi8, stamceller behandling9, retinal transplantation10, och konstgjorda stimulering11,12 av de överlevande retinala nervcellerna. Av dessa är den mest kliniskt tillgängliga retinal proteser, som är konstgjorda neurostimulering enheter som traditionellt har använt en matris av elektroder att elektriskt stimulera bipolära celler eller RGCs i ett specifikt mönster med målet att att skapa konstgjorda visuella föreställningar i patienter11. Nuvarande generationen elektriska proteser, såsom Argus II13 och Alpha-IMS14 enheter, har uppnått klinisk godkännande och preliminära studier har visat att de kan förbättra livskvaliteten för patienter genom att återställa en mått på vision använder både epiretinal (framsidan av näthinnan) och subretinala (baksidan av näthinnan) implanteras enheter15,16. Forskargrupper runt om i världen arbetar på att vidareutveckla retinal proteser bortom dessa första generationens enheter17,18,19,20 framgångar men har inför svårigheter utforma en elektrisk protes kan återställa hög synskärpa vision under den juridiska blindhet nivån till patienter. Nyare studier har visat att uppnå högre spatial upplösning än som aktiveras av den nuvarande generationen elektriska-baserade proteser är utmanande på grund av kostnad injektion gränsen, som kräver användning av stora elektroder att säkert stimulera retinala nervceller på bekostnad av rumslig upplösning, dvs synskärpa11,21. Elektrisk stimulering är dessutom ytterligare begränsad eftersom det vanligtvis stimulerar alla närliggande celler och därför väcker onaturliga och förvirrande uppfattningar hos patienter, till stor del eftersom det är en inneboende onaturliga stimulering paradigm21. Ändå, de tidiga framgångarna av elektrisk stimulering har visat att konstgjorda neurostimulering kan vara en effektiv behandling för ljusmätare degenerativa sjukdomar. Detta leder till hypotes att en ännu effektivare behandling kan vara möjlig genom att stimulera näthinnan med neurotransmittor kemikalier, naturliga agenter för kommunikation vid kemiska synapser. Syftet med metoden presenteras i denna uppsats är att undersöka terapeutiska genomförbarheten av kemisk stimulering, som syftar till att efterlikna det naturliga systemet av synaptisk kommunikation mellan näthinnans nervceller, som ett alternativ till elektrisk stimulering för biomimetiska för en retinal protes.
Översättning av begreppet terapeutisk kemisk stimulering till en kemisk retinal protes är beroende av kemiskt aktivera target retinala nervceller med små mängder av infödda neurotransmittorer, såsom Glutamat, släppt igenom en mikroflödessystem enhet bestående av ett stort utbud av microports svar på visuell stimulans. På detta sätt skulle en kemisk retinal protes i huvudsak vara ett lager av biomimetiska-konstgjorda ljusmätare som översätter fotoner naturligt når näthinnan till kemiska signaler. Eftersom dessa kemiska signaler använder de samma signalsubstanser som utnyttjas i normala retinal signalering och stimulera överlevande retinala nervceller i en urartad näthinnan på samma synaptic stigar som används av normal syn vägar, den resulterande visuellt uppfattning som uppnås genom en kemisk retinal protes kan vara mer naturligt och begripligt jämfört med en frammanade genom en elektrisk protes. Dessutom eftersom den microports genom vilka neurotransmittorer frigörs kan göras extremt liten och klädd i hög densitet, till skillnad från elektroderna, en potentiella kemiska protetiska kan vara duglig till åstadkomma mer fokal stimulering och högre spatial upplösning än en elektrisk protes. Således, utifrån dessa potentiella fördelar, en kemisk retinal protes erbjuder ett mycket lovande alternativ till elektriska proteser.
Kemisk stimulering av näthinnan, men har varit relativt lite utforskat tills nyligen. Medan elektrisk stimulering av näthinnan har karakteriserats väl över decennier av arbete genom in vitro22,23, i vivo23,24och kliniska studier13 ,14, studier på kemisk stimulering har varit begränsade enbart till ett fåtal in vitro- verk25,26,27,28. Iezzi och Finlayson26 och Inayat o.a. 27 visat epiretinal kemisk stimulering av näthinnan i vitro med en enda elektrod och en multielectrode (MEA), respektive att registrera glutamat frammanade Svaren av retinala nervceller. Mer nyligen, Rountree o.a. 28 visat differentiell stimulering av de på och retinal vägar med glutamat från den subretinal sidan och en MEA för att registrera de neuronala svar från flera platser på näthinnan.Även om dessa verk har preliminärt fastställt genomförbarheten av kemisk stimulering, ytterligare studier är nödvändiga för att undersöka många aspekter av detta tillvägagångssätt utöver de upp hittills25,26,27 , 28, och finjustera parametrarna terapeutisk stimulering i både in vitro- och in-vivo djurmodeller innan att översätta konceptet till en kemisk retinal protes som diskuterats ovan. Men för närvarande finns det ingen etablerad metodik för fullbordande av kemisk stimulering av näthinnan i litteraturen och de metoder som används i tidigare verk har inte beskrivits i sådan detalj som skulle vara avgörande för replikationsförmåga studier. Den logiska grunden för denna metoder uppsats är därför att tillhandahålla en väldefinierad ram för att genomföra in vitro- kemisk stimulering av näthinnan för de intresserade antingen replikera våra tidigare studier27, utredarna 28 eller ytterligare framåt denna begynnande begreppet kemiska neurostimulering.
Här visar vi en metod för att genomföra in vitro- kemisk stimulering av retinala nervceller i wholemount näthinnor av vildtyp råttor och en ljusmätare degenererade råtta modell som noggrant efterliknar progressionen av ljusmätare degenerativa sjukdomar hos människor. Logiken bakom utveckla denna stimulering metod i in vitro- modeller är att utvärdera de terapeutiska intervall av olika stimulering parametrar och studera neural respons egenskaper som skulle vara omöjligt eller svårt att Observera i i vivo modeller, särskilt under de första studierna fokuserade på att utvärdera genomförbarheten av denna strategi. I den här proceduren visar vi både plats och samtidiga multi-site kemiska stimuli av näthinnor genom att leverera små mängder av 1 mM glutamat nära målet retinala nervceller via kommersiellt tillgängliga single-port glas Mikropipetter och en anpassad micromachined multi-port mikroflödessystem enhet, respektive. Medan både singel- och multi stimuli uppnå det grundläggande målet att undersöka terapeutiska genomförbarheten av kemiska neuromodulation, ändamålsenlig varje distinkta med en unik fördel. Den enda plats stimulering, som kan åstadkommas med kommersiellt tillgängliga före drog glas Mikropipetter, kan användas för att injicera kemikalier direkt i ytan av näthinnan på en enda sajt och tjänar till att undersöka om observerbara RGC spike ränta Svaren som liknar visuellt framkallat ljus Svaren kan utlösas focally under injektionsstället. Däremot, multi-site stimulering, som kräver ett speciellt fabricerade multiport mikroflödessystem enhet, kan användas för att injicera kemikalier rumsligt på flera platser över ytan av näthinnan och tjänar till att undersöka hur väl glutamat-framkallat RCG svar mönster motsvarar glutamat injektion mönster i mönster stimulering studier.
Metoden presenteras här visar en unik nervstimulering paradigm, retinala nervceller stimuleras vari kemiskt genom att injicera infödda neurotransmittor kemikalier i ytan av näthinnan in vitro. Denna kemiska stimulering teknik ger flera fördelar över den konventionella elektriska stimulering teknik, inklusive selektivitet och hög fokal specificitet av målet nervceller. Protokollet över Detaljer hur liten volym pneumatiska injektioner av signalsubstansen glutamat levereras nära målet retinala nervceller …
The authors have nothing to disclose.
Det arbete som presenteras i tidningen stöddes av National Science Foundation, framväxande gränser i forskning och Innovation (NSF-EFRI) program bevilja nummer 0938072. Innehållet i detta dokument är endast ansvarig för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av NSF. Författarna vill även tacka Dr Samsoon Inayat för hans arbete designa och testa den första experimentella konfigurationen för kemisk stimulering och Mr Ashwin Raghunathan för hans arbete utforma, tillverka och utvärdera multiport mikroflödessystem enheten används i denna studie.
Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1_HAUK_ProductDetail |
Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |