פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור חוקרים צורת בגירוי הכימית של wholemount חולדה הרשתיות במבחנה עם גלוטמט עצבי. בגירוי כימי הוא אלטרנטיבה מבטיחה בגירוי חשמלי המקובלת של הנוירונים ברשתית לטיפול עיוורון בלתי הפיך הנגרם על ידי מחלות ניווניות קולט אור.
מחלות ניווניות קולט אור לגרום לעיוורון בלתי הפיך דרך אובדן הדרגתי של קולט אור תאים ברשתית. תותבות ברשתית הם טיפול המתעוררים עבור מחלות ניווניות קולט אור אשר מבקשים לשחזר את הראייה על ידי גירוי מלאכותי הנוירונים ברשתית ששרדו, בתקווה לקבל תפיסה ויזואלית מובנים בחולים. תותבות ברשתית הנוכחית הוכיחו הצלחה שיקום הראייה המוגבלת לחולים באמצעות מערך של אלקטרודות חשמלית לעורר הרשתית אך להתמודד עם מחסומים פיזיים ניכר שחזור חדות גבוהה, ראייה טבעית לחולים. בגירוי כימי באמצעות נוירוטרנסמיטורים מקורית גירוי אלטרנטיבה חשמל ביונים, נוכל לעקוף את המגבלות הבסיסיות הקשורות ברשתית תותבות שימוש בגירוי חשמלי. באופן ספציפי, בגירוי כימי יש פוטנציאל כדי לשחזר את חזון טבעי יותר עם acuities דומות או יותר של visual מטופלים בהזרקת כמויות קטנות מאוד של נוירוטרנסמיטרים, הסוכנים טבעי אותו לתקשורת המשמשת רשתית כימית synapses, ברזולוציה יותר עדינה יותר מאשר תותבות חשמל הנוכחי. עם זאת, כמו פרדיגמה גירוי נחקרו יחסית, אין שום פרוטוקול הוקמה להשגת גירוי כימי של ה רשתית במבחנה. מטרת עבודה זו היא לספק מסגרת מפורטת לביצוע גירוי כימי של הרשתית לחוקרים המבקשים ללמוד על פוטנציאל של neuromodulation כימי של הרשתית או דומה רקמות עצביות בתוך חוץ גופית. בעבודה זו, אנו מתארים את הגדרת הניסוי ואת מתודולוגיה העלאת גנגליון תא (מהרשות לשיקום האסיר) ספייק תגובות הדומה חזותית אור תגובות בפראי-סוג ומבוקר מנוון-קולט אור wholemount הרשתיות חולדה על ידי הזרקת כרכים של גלוטמט עצבי אל החלל subretinal באמצעות micropipettes זכוכית והתקן מותאם אישית microfluidic מרובה. מתודולוגיה זו ופרוטוקול הם כללי מספיק כדי להיות מותאם neuromodulation באמצעות עצביים אחרים או אפילו אחרים רקמות עצביות.
מחלות ניווניות קולט אור, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, הקשורות לגיל ניוון מקולרי, מובילים גורם בירושה של אובדן ראייה, כיום חשוכת מרפא1,2. למרות מחלות אלו נובעים מגוון מוטציות גנטיות מסוימות, מחלות ניווניות קולט אור מאופיינים כקבוצה אובדן הדרגתי של תאי קולט אור ברשתית, הגורמת בסופו של דבר לעיוורון. האובדן של גורמים photoreceptors נפוצה שיפוץ לאורך הרשתית אבל לשרוד את הנוירונים ברשתית, כולל תאים דו-קוטביים, RGCs, נותרו ללא פגע ופונקציונליים יחסית אפילו בשלבים מתקדמים של קולט אור ניוון3 ,4,5,6,7.
מנגנונים של פתולוגיות המחלות האלה היה טוב מאופיין3,4,5,6,7 אך טיפול יעיל עודנו. בשלושת העשורים האחרונים, חוקרים ברחבי העולם יש חקר מגוון רחב של טיפולים רפואיים עבור שחזור חזון אלה מושפעים עם קולט אור מחלות ניווניות כולל טיפול גנטי8, טיפול בתאי גזע9, השתלת רשתית10ו-11,לגירוי מלאכותי12 של הנוירונים ברשתית ששרדו. אלה, זמינים ביותר קלינית הם פרותזה ברשתית, אשר הם התקנים מלאכותיים בגירוי באופן מסורתי נעזרו מערך אלקטרודות חשמלית לגרות את התאים הפרעה דו קוטבית או RGCs בתבניות ספציפיות עם המטרה של יצירת תפיסות חזותי מלאכותית לחולים11. פרותזה חשמל הדור הנוכחי, כגון ארגוס II13 ו אלפא-IMS14 מכשירים, השיגו אישור רפואי, מחקרים ראשוניים הראו כי הם יכולים לשפר את איכות החיים לחולים על-ידי שחזור מידת הראייה באמצעות על פני רישתית (קדמי של הרשתית) והן subretinal (מאחורי הרשתית) מושתלים מכשירי15,16. קבוצות מחקר ברחבי העולם פועלים לקידום תותבות ברשתית מעבר ההצלחות של אלה מכשירים דור ראשון17,18,19,20 אבל התמודדו קשיים בעיצוב של תותבת חשמלי מסוגל לשחזר גבוהה חדות הראייה מתחת לרמת עיוורון משפטי לחולים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השגת ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר מאשר זה מופעל על ידי הדור הנוכחי תותבות מבוססות חשמל הוא מאתגר בגלל המגבלה הזרקת תשלום, אשר מחייבת את השימוש אלקטרודות גדול לעורר בבטחה הנוירונים ברשתית במחיר של רזולוציה מרחבית, קרי ראייה11,21. יתר על כן, גירוי חשמלי הוא יותר מוגבל כי היא בדרך כלל מעוררת את כל התאים הסמוכים, ולכן מעורר תפיסות לא טבעי ומבלבל בחולים, בעיקר בגלל שזה הפרדיגמה21גירוי טבעי מטבעו. ובכל זאת, ההצלחות מוקדם של גירוי חשמלי הדגימו שבגירוי המלאכותי הזה יכול להיות טיפול יעיל עבור מחלות ניווניות קולט אור. זה מוביל אחד משערים כי טיפול יעיל עוד יותר יהיה בר השגה על ידי גירוי הרשתית עם עצבי כימיקלים, הסוכנים הטבעי של הסנסור הסינפסות כימי. מטרת השיטה המובאת בעיתון הזה היא לבחון את הכדאיות טיפולית של גירוי כימי, אשר מבקש לחקות את המערכת הטבעית של סינפטית תקשורת בין הנוירונים ברשתית, כמו גירוי אלטרנטיבה חשמל ביונים עבור תותבת ברשתית.
תרגום של המושג טיפולית גירוי כימי תותבת ברשתית כימי מסתמך על כימית הפעלת המטרה הנוירונים ברשתית עם כמויות קטנות של נוירוטרנסמיטרים מקורי, כגון גלוטמט, באמצעות microfluidic התקן הכוללת מגוון רחב של microports בתגובה גירוי חזותי. בדרך זו, תותבת ברשתית כימי יהיה בעצם שכבה קולט אור מלאכותי ביונים המתרגמת פוטונים באופן טבעי להגיע הרשתית לאותות כימיים. מאז אותות כימיים אלה להשתמש את אותם מעבירים עצביים מנוצל איתות ברשתית נורמלי ולעורר את הנוירונים ברשתית ששרד הרשתית מנוונת דרך מסלולים סינפטית אותו בשימוש על ידי חזון נורמלי מסלולים, הדימוי שנוצר התפיסה מושגת באמצעות תותבת ברשתית כימי יכול להיות מובנת וטבעית יותר בהשוואה אחד ברמיזות על הפרוטזה חשמל. יתר על כן, מאז microports שדרכו משתחררות נוירוטרנסמיטורים יכולים להתבצע מאוד קטנים, ערוכים בצפיפות גבוהה, בניגוד האלקטרודות, חומר כימי פוטנציאלי תותב עשוי להיות מסוגל להשיג הרבה יותר. גירוי מוקד ומעלה מרחבית רזולוציה יותר תותבת חשמל. לפיכך, בהתבסס על יתרונות פוטנציאליים אלה, תותבת ברשתית כימי מציע אלטרנטיבה תותבות חשמל מאוד מבטיח.
גירוי כימי של הרשתית, עם זאת, יש יחסית מעט נחקרו עד לאחרונה. בזמן גירוי חשמלי של הרשתית מאפיין טוב במשך עשרות שנים של עבודה דרך חוץ גופית ב22,23 ויוו23,24, מחקרים קליניים13 ,14, מחקרים על גירוי כימי היה מוגבל אך ורק כמה במבחנה עבודות25,26,27,28. Iezzi ו- Finlayson26 ואברהם זילברשלג. et al. 27 הפגינו על פני רישתית גירוי כימי של ה רשתית במבחנה באמצעות אלקטרודה אחת של מערך multielectrode (מאה), בהתאמה, כדי להקליט את התגובות גלוטמט עורר של הנוירונים ברשתית. לאחרונה, Rountree. et al. 28 הפגינו גירוי דיפרנציאלית של המסלולים ברשתית לסירוגין באמצעות גלוטמט מן הצד subretinal MEA להקליט את התגובות עצביים מאתרים מרובים על הרשתית.למרות עבודות אלו preliminarily הקימו את הכדאיות של גירוי כימי, יותר מחקרים הם חיוניים כדי לחקור רבים מההיבטים של גישה זו מעבר לאלה התייחס כה26,25,27 , 28, והגדר את הפרמטרים גירוי טיפולית במודלים של בעלי חיים גם במבחנה וגם ויוו לפני לתרגם את המושג הזה כדי תותבת ברשתית כימי כמתואר לעיל. עם זאת, כיום יש אין מתודולוגיה הוקמה לביצוע גירוי כימי של הרשתית בספרות, האמצעים שננקטו בעבודות קודמות לא תוארו בפירוט כזה יהיה חיוני ללימודים replicative. לכן, הרציונל שבבסיס מאמר שיטות היא לספק מסגרת מוגדרים היטב עבור ניצוח במבחנה גירוי כימי של הרשתית לחוקרים הללו מעוניינים או שכפול שלנו הקודם מחקרים27, 28 או נוסף לקידום רעיון nascent בגירוי כימי.
כאן נדגים שיטה עבור ניצוח במבחנה גירוי כימי של הנוירונים ברשתית ב wholemount הרשתיות של חולדות פראי-סוג ודגם קולט אור עכברוש מנוונת כי מקרוב מחקה את ההתקדמות של קולט אור ניוונית מחלות בבני אדם. הרציונל מאחורי פיתוח שיטה זו גירוי במודלים במבחנה הוא להעריך את הטווחים טיפולית של פרמטרים גירוי שונים וללמוד מאפייני תגובה עצבית, זה יהיה בלתי אפשרי או קשה להתבונן ב- ב ויוו מודלים, במיוחד במהלך הלימודים הראשוני התמקדו להערכת הכדאיות של גישה זו. בהליך זה, אנו מראים גם יחיד-אתרים וגם בו זמנית אתר רב stimulations כימית של הרשתית על-ידי אספקת כמויות קטנות של 1 מ מ גלוטמט ליד היעד הנוירונים ברשתית דרך זכוכית אחת זמינים מסחרית micropipettes מותאמת אישית ההתקן microfluidic מרובת יציאות micromachined, בהתאמה. בעוד stimulations יחיד-אתרים וגם אתר רב להשיג את המטרה הבסיסית של חוקרים את הכדאיות טיפולית של neuromodulation כימי, אחד משרת מטרה ברורה עם יתרון ייחודי. גירוי בודד-אתרים, אשר יכול להתבצע עם זכוכית מראש משך זמינים מסחרית micropipettes, יכול לשמש כדי להזריק חומרים כימיים ישירות לתוך מהסבא של הרשתית באתר אחד ומגישה כדי לחקור אם מהרשות לשיקום האסיר הנצפה ספייק קצב תגובות דומות מבחינה ויזואלית עורר תגובות האור יכול להיות elicited focally תחת ההזרקה. מצד שני, ריבוי האתר גירוי, הדורש מכשיר מיוחד מפוברק microfluidic מרובה, יכול לשמש כדי להזריק חומרים כימיים במרחב באתרים מרובים על-פני הרשתית ומגישה לחקור כיצד גם עורר גלוטמט קבוצת ריינהולד כהן דפוסי תגובה תואמות התבניות להזרקת גלוטמט במחקרים גירוי דפוס.
השיטה המוצגת כאן מדגים פרדיגמה גירוי עצבי ייחודי, שבו הנוירונים ברשתית הם גירוי כימי על ידי הזרקת כימיקלים עצבי יליד לתוך מהסבא של הרשתית חוץ גופית בתוך. טכניקה זו גירוי כימי מציעה מספר יתרונות הטכניקה המקובלת גירוי חשמלי, כולל סלקטיביות וספציפיות מוקד גבוהה של נוירונים היעד. בפרוטו?…
The authors have nothing to disclose.
העבודה הציגה בעיתון נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע, המתעוררים גבולות במחקר ולהעניק חדשנות (NSF-EFRI) תוכנית מספר 0938072. תוכן המאמר אינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של ה-NSF הינם אך ורק באחריות של המחברים. המחברים גם רוצים להודות ד ר Samsoon אברהם זילברשלג על עבודתו בעיצוב ובדיקה ההגדרה הראשונית ניסיוני לגירוי כימי מר Ashwin Raghunathan עבור עבודתו בעיצוב, בדיית, הערכת המכשיר microfluidic מרובה בשימוש מחקר זה.
Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1_HAUK_ProductDetail |
Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |