血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法
Summary
我々 は異所萌出へ自己免疫性脳炎が疑われる患者の血中 NMDA 受容体に対する自己抗体を検出する抗原としてヒト胚性細胞 (HEK293) で緑色蛍光タンパク質が付いた NMDA 受容体の NR1 サブユニットを表明しました。この単純な方法はスクリーニング目的のため臨床現場で適切な可能性があります。
Abstract
抗 NMDA 受容体抗体の存在は、影響を受ける患者は、抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎と呼ばれるさまざまな神経精神症状を引き起こします。血液や脳脊髄液 (CSF) の NMDA 受容体に対する特定の自己抗体の検出は、この条件の正確な診断のために不可欠です。NMDA 受容体は、イオン チャネル蛋白質複合体 2 つ必須 NMDA 受容体サブユニット 1 (NR1) と 1 つまたは 2 つの NMDA 受容体を含む 4 つのサブユニットを含むサブユニット 2 a (NR2A) NMDA 受容体サブユニット 2B NR2B、NMDA 受容体サブユニット 2 C (NR2C) または NMDA 受容体サブユニット 2 D (NR2D)。抗 NMDA 受容体抗体のエピトープは、NMDA 受容体の NR1 サブユニットの細胞外 N 末端ドメインに存在すると報じられました。本研究の目的は臨床および基礎研究を容易にするために血液の NMDA 受容体の NR1 サブユニットに対する抗体の存在を検出するスクリーニング検査として使用できる単純な細胞を用いた蛍光抗体法を開発、します。抗 NMDA 受容体の自己免疫性脳炎。
Introduction
抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎は、すべての年齢の患者に発生することができます、主に女性患者1,2に影響を与える新たに認められた疾患エンティティです。脳炎3の初期原因不明患者の間で最も頻繁に診断された脳炎の一つです。通常抗 NMDA 受容体脳炎で被害を受けた患者は、頭痛や発熱、意識レベルの変化、様々 な撹拌、過敏症など急性の神経精神症状の迅速な開発が続くの前駆症状を持っています。、不安、不眠、幻覚、妄想、侵略、奇妙な行動、運動異常、自律神経の調節不全や発作の攻撃4,5。この条件とタイミング療法と免疫療法を早期より良い結果と影響を受ける患者6も完全復旧のため重要です。したがって、抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎は急性または新規発症の精神機能7、8を呈する患者の鑑別診断として考慮されるべきことをお勧めします。
臨床的特徴のほかに血液や脳脊髄液の NMDA 受容体に対する自己抗体の検出は抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎9の正確な診断に不可欠です。ほとんどの抗 NMDA 受容体抗体を検出する免疫学的テストがいくつか研究所10,11, で利用可能なスクリーニングのための 1 つだけの市販細胞を用いた蛍光抗体法、抗 NMDA 受容体抗体12。本研究の目的は抗 NMDA 受容体の臨床研究を促進する抗 NMDA 受容体抗体の存在感を画面に実験室で便利に使用できる単純な社内細胞を用いた蛍光抗体を開発するには自己免疫性脳炎。NMDA 受容体は heterotetramer イオン チャネル蛋白質の複合体、脳で特異的に発現します。それはの 2 つの強制 NR1 サブユニットと NR2A、NR2B、NR2C、NR2D の13の 1 つまたは 2 つのサブユニットの組み合わせでください。以前の研究は、その抗体の対象となる主なエピトープは NR1 サブユニット5の細胞外 N 末端ドメインを報告しました。したがって、このプロトコルでは我々 は人間の萌芽期の腎臓上皮細胞株 (HEK293) で緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いた NMDA 受容体の人間の組換えの NR1 サブユニット蛋白質を表現し、検出する細胞を用いた蛍光抗体法を開発血液中の抗 NMDA 受容体抗体の IgG クラス。
Protocol
Representative Results
Discussion
生きている細胞を用いた蛍光アッセイ11、固定細胞を用いた蛍光抗体法9 を含む文献で報告された NMDA 受容体に対する自己抗体の存在を画面にいくつか細胞を用いた免疫学的アッセイには、流れの cytometry ベース測定14。生きている細胞を用いた蛍光抗体法は、流れの cytometry ベース試金は、訓練された人員および特別な装置を必要とする間…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、チャン庚医学財団 (許可番号 CMRPG3C1771、CMRPG3C1772、CMRPG3E0631、CMRPG3E0632、および CMRPG3E0633) によって支えられました。
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
