Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed model te bestuderen van axonale en intracellulair transport. Hier beschrijf ik een protocol voor in vivo opname en analyse van axonale en intraflagellair vervoer in C. elegans.
Abstract
Axonale vervoer en intraflagellair (IFT) zijn essentieel voor de axon en cilia genuitdrukking en functie. Kinesin superfamilie eiwitten en dynein zijn moleculaire motoren die anterograde en retrograde vervoer, respectievelijk regelen. Deze motoren gebruiken microtubulus netwerken als rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtige modelorganisme axonale vervoer en IFT in vivote studeren. Hier beschrijf ik een protocol om te observeren axonale vervoer en IFT in levende C. elegans. Vervoerde lading kan worden gevisualiseerd door tagging lading eiwitten met behulp van fluorescente proteïnen zoals groen fluorescente proteïne (GFP). C. elegans is transparant en lading GFP-gelabelde proteïnen kunnen worden uitgedrukt in specifieke cellen onder cel-specifieke initiatiefnemers. Levende wormen kunnen worden opgelost door microbeads op 10% agarose gel zonder doden of anesthetizing van de wormen. Onder deze omstandigheden, vracht verkeer kan direct worden waargenomen in de axonen en cilia van levende C. elegans zonder dissectie. Deze methode kan worden toegepast op de waarneming van elke lading molecule in cellen door aanpassing van de doel-eiwitten en/of de cellen die ze zijn uitgedrukt in. Meest elementaire eiwitten zoals moleculaire motoren en adaptor eiwitten die bij axonale vervoer en IFT betrokken zijn zijn bewaard in C. elegans. Vergeleken met andere modelorganismen, zijn mutanten verkregen en gemakkelijker te onderhouden in C. elegans. Deze methode te combineren met verschillende C. elegans mutanten kan verduidelijken de moleculaire mechanismen van axonale vervoer en IFT.
Introduction
Levende cel imaging is een essentieel instrument voor het analyseren van intracellulair transport. In de neuronale celbiologie zijn analyses van axonale vervoer met levende cel beeldvorming essentieel voor een goed begrip van de neuronale functie en morfogenese1. Defecten in axonale vervoer ten grondslag liggen aan diverse neurodegeneratieve aandoeningen2. Kinesin superfamilie eiwitten en dynein dragen uit axonale vervoer anterogradely en retrogradely, respectievelijk1,2.
Cilia zijn een andere cellulaire compartiment waarin de microtubulus netwerk en mensenhandel machines hoogontwikkelde3 zijn. Eiwit synthese machines is niet vertaald in cilia, wat betekent dat Ciliaire eiwitten van het cytoplasma naar de cilia tips moeten worden vervoerd. Cilia-specifieke kinesin en dynein, kinesin-2 en cytoplasmatische dynein-2, respectievelijk genoemd, [LbMarket_Transport] de componenten van de cilia4, een verschijnsel genaamd intraflagellair vervoer (IFT)5. Bijzondere waardevermindering van IFT veroorzaakt een spectrum van ziekten genaamd ciliopathies6. Analyse van het mechanisme van de IFT door levende cel imaging is dus vereist om te begrijpen van de basismechanismen van Ciliaire vorming en pathogenese.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed model axonale vervoer en IFT7,8,9te gaan studeren. Om te observeren IFT, is Chlamydomonas wijd verbeid gebruikt als een model organisme5,6. Zoals Chlamydomonas een eencellige organisme is, zou de relatie van IFT met veroudering, neuronale functie, en gedrag moeilijk te analyseren zijn. Essentiële genetische technieken zoals CRISPR/Cas9 zijn bovendien niet toegepast op Chlamydomonas. In hogere modelorganismen, zoals muizen en Drosophila, veroorzaakt verstoring van axonale vervoer en IFT vaak dodelijke fenotypen omdat axonale vervoer en IFT essentieel voor de voedselproductie en de homeostase van de dieren 10zijn, 11. In het geval van muizen, is celkweek en transfectie over het algemeen nodig om te observeren axonale vervoer en IFT, waarvoor veel vaardigheden en uitgebreide tijd12,13. Daarnaast kan een heleboel belangrijke fysiologische context in gekweekte cellen en cellijnen worden verloren. Omdat het zenuwstelsel niet essentieel voor het voortbestaan van de wormen is, C. elegans mutanten in welke axonale vervoer of IFT worden verstoord zijn vaak niet dodelijk7,9,14. Axonale vervoer en IFT direct waarneembaar in vivo zonder dissectie omdat C. elegans is het transparante en het is daarom gemakkelijk te observeren GFP-gelabeld markeringen.
Er zijn verschillende protocollen te immobiliseren C. elegans, zoals het gebruik van een microfluidic apparaat15, agarose pads met verdoving16of microbeads17. De opneming van de verdoving kan de mensenhandel gebeurtenissen in neuronen15remmen. Een duidelijk nadeel van de methode van de microfluidic-apparaat is dat voorbereiding van een microfluidic-apparaat niet altijd gemakkelijk is. In plaats daarvan, immobilisatie door agarose pads en microbeads is een handige en gemakkelijke manier om uit te voeren tijd vervallen imaging in C. elegans. Hier beschrijf ik dit basisprotocol te immobiliseren C. elegans en visualiseren van axonale vervoer en IFT in vivo in C. elegans. In vergelijking met de andere methoden, de hier beschreven methode vereist geen speciale apparatuur en is veel goedkoper en eenvoudiger uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de monsters
- genereren een transgene C. elegans stam van belang met behulp van transgene methodologieën 18. U kunt ook verkrijgen geschikte stammen uit de Caenorhabditis genetica Center (CGC). Om te visualiseren axonale vervoer van synaptic vesikel precursoren, gebruiken de transgene lijn wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Te observeren IFT, verkrijgen de transgene lijn mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Deze stammen worden gebruikt in dit protocol.
Opmerking: Een extrachromosomal matrix, genomic integratie of zelfs GFP knock-in de werken. Verklein achtergrond signalen en het gebruik van cel-specifieke initiatiefnemers, in plaats van pan-neuronale initiatiefnemers.
Opmerking: Onderhoud van wormen in andere protocollen 20 wordt beschreven. Stammen werden gehandhaafd op gazons van Escherichia coli OP50 feeder op nematode groei middellange (NGM) platen (1,7% (m/v) agarose, 50 mM NaCl, 0,25% (m/v)-pepton, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL cholesterol, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 op 60 mm diameter kunststof gerechten) bij 20 ° C. - Groeien wormen bij 20 ° C op NGM platen enig stadium van de levenscyclus van de wormen.
Opmerking: Men kan in elk stadium zowel axonale vervoer en IFT observeren. Laat L4 naar jongvolwassene is een goede positieve controle omdat meerdere publicaties hebben gebruikt deze fasen en gevisualiseerde mensenhandel evenementen 14 , 21 , 22 , 23.
2. Voorbereiding van 10% Agarose
Opmerking: veel leveranciers bieden soortgelijke producten zoals scheuten agar agar poeders en agarose. Gebruik van elektroforese rang agarose (gel sterkte > 1200 g/cm 2). Goedkope agar poeders werken niet omdat de resulterende gel is niet sterk genoeg om te immobiliseren wormen.
- Mix 0.4 g agarose in 4 mL gedestilleerd water (DW) in een glazen buis (1,5 cm x 10,5 cm). Zet een deksel op de glazen buis om verdamping.
- Zet de glazen buis op een blok warmte 95 ° C gedurende 90 minuten. Daarnaast bereiden een andere glazen buis (1,5 cm x 10,5 cm) gevuld met DW en houden het op 95 ° C. zet een pipet van Pasteur in de 95 ° C DW ( Figuur 1). Een heleboel kleine bubbels zal blijken in de agarose buis en de oplossing moet troebel. Laat de oplossing pas duidelijk. Meng door pipetteren op en neer totdat de agarose oplossing homogene wordt.
Opmerking: Microgolven kunnen niet worden gebruikt voor het bereiden van 10% agarose oplossing wanneer gemaakt van DW en agarose. Kleine bellen veroorzaakt door microgolven voorkomen agarose smelten. Echter kan verhard 10% agarose gel gemakkelijk worden gesmolten weer met behulp van een magnetron. Glazen buizen met 10% agarose gel kunnen worden bereid tijd vooruit en opgeslagen bij 4 ° C gedurende ten minste 6 maanden. Als doen, smelten de voorraad met behulp van een magnetron wanneer nodig en te beginnen vanaf stap 3 in dit protocol.
Opmerking: Agarose verliest geleidelijk het vermogen om te stollen als geïncubeerd bij 95 ° C voor een lange tijd of na herhaalde stollen en smelten. Als dit gebeurt, bereiden nieuwe 10% agarose.
3. Voorbereiding van Agarose Pad
- met behulp van de verwarmde Pasteur Pipetteer bereid in stap 2.2, 2 druppels 10% agarose plaats op een dia 76 x 22 mm.
- Snel cover met een tweede 76 x 22 mm 2 dia voordat de daling van de agarose stolt zoals aangegeven in Figuur 1 B en duw naar beneden op de tweede dia om plat de agarose oplossing. De dikte moet 0,5-1 mm.
- Snel spoel de Pipet van Pasteur door pipetting 95 ° C DW op en neer totdat het agarose oplossing is weggespoeld. Anders, zal de Pipetteer verstopt raken door agarose gel. Laat de pipet in de 95 ° C DW.
- Wachten op 1 min. Het stootkussen agarose vormt en weer troebel wordt. Dan, schuift u de dia's uit elkaar met de hand ( Figuur 1 C).
4. Montage van wormen
Opmerking: zelfs kleine hoeveelheden van worm verkeer voorkomen dat goede observatie. Levamisole heeft van oudsher gebruikt om worm beweging op de agarose pad 24 , 25 te voorkomen. Echter Levamisole neuronale receptoren in C. elegans remt en daardoor mensenhandel gebeurtenissen in neuronen 15 kan beïnvloeden. Met behulp van polystyreen microbeads beschreven hereis een goede alternatieve 17.
- Houdt in een stereomicroscoop uitgerust met een verschuifbare spiegel transillumination, ~ 30 transgene wormen uiting geven aan de juiste markeringen naar een nieuwe NGM plaat zonder bacteriën met behulp van een platina draad halen.
Opmerking: Een draad van platina-pick is gemaakt van platina-draad en Pipet van Pasteur (5 inch), en het uiteinde van de draad van platina werd afgevlakt. De voorbereiding van de platina-draad Tips en behandeling van wormen met deze worden beschreven in de Wormbook (http://www.wormbook.org). - Laat de plaat voor 1 min. bacteriën automatisch verwijderd uit de oppervlakken van wormen als de wormen op NGM agarose gel zonder bacteriën verplaatsen.
- Put een 0,5-1,0 µL daling van 2,6% 100 nm diameter polystyreen microbeads in water op de agar pad ( Figuur 1 D). 10-20 wormen uit de plaat NGM bacteriën vrij naar de microbeads overbrengen. Drop en verspreiding de wormen met behulp van het platina-draad plukken om te voorkomen dat de overlapping van worm organen ( Figuur 1 E).
- Breng een dekglaasje aan van 22 x 40 mm, 2 ( Figuur 1 F). Zachtjes duwen om luchtbellen te verwijderen, maar verpletterende wormen te voorkomen. Het monster is nu klaar voor imaging.
Opmerking: Omdat geen narcose wordt toegediend, wormen worden opgelost alleen door de wrijvingskracht gegenereerd door de agar pad, polystyreen microbeads en dekglaasje aan 17. De aanwezigheid van feeder bacteriën en/of teveel oplossing zal de wrijvingskracht zwakkere.
Opmerking: Verschillende maten van coverslips (b.v., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) werken. Echter grotere coverslips kunt voorkomen dat onderdompeling water of olie uit het objectief lekken in de monsters tijdens de observatie.
5. Observatie
Opmerking: juiste imaging parameters (laser macht krijgen, weggooien, enz.) zal verschillen voor elk systeem van de Microscoop en een camera. Hier, een widefield Microscoop voorzien van een draaiende schijf confocal scanner en een digitale CCD-camera wordt gebruikt.
- De temperatuurregeling van het werkgebied ingesteld op 20 ° C of aan te passen van de kamer temperatuur op 20 ° C.
- Zet de voorbeelddia op het stadium van de Microscoop. 100 x gebruikt (numerieke diafragma = 1.3 of hoger) objectief.
- Zoekt de gebieden aangegeven in Figuur 2 (voor wyIs251 en axonale vervoer) of Figuur 2 B (voor mnIs17 en IFT) als positieve controle . Andere gebieden kunnen worden geanalyseerd als goed 22.
- Set parameters (CCD winst = 200, Binning = 1 of 2, laser macht op 488 nm = 1.0-1.3 mW). Tijd lapse opname op 4 frames/s voor maximaal 1 min. bestanden op te slaan als mutli-TIFF formaat uitvoeren.
Opmerking: Als GFP signalen verdwijnen en het is moeilijk te blijven observeren van GFP::RAB-3 of OSM-6::GFP voor 30 s, de kracht van de laser is te sterk. In dat geval, verminderen de kracht van de laser. Omgekeerd, wanneer geen vesiculaire beweging is vastgelegd, de kracht van de laser is te zwak. In dat geval de laser macht vergroten. - Een andere worm observeren en herhaal 5.3 en 5.4. De opmerkingen voor maximaal 20 min kunnen duren, maar elke worm slechts eenmaal moet worden geregistreerd om te voorkomen dat de gevolgen van pHOTO schade.
Opmerking: Wormen hebben waargenomen gedurende ten minste 20 minuten zonder aanzienlijke gebreken 7 , 27 , 28. Langere observatie mogelijk maar haven ' t is nog getest. Een duidelijk teken van neuronale dood is de verandering van neuronale morfologie zoals neurite zwelling. Zoals zwakke signalen van GFP kunnen worden gezien in de axonen en dendrites in zowel wyIs251 als mnIs17, kan neurite morfologie gemakkelijk worden gecontroleerd door gewoon te kijken axonen of dendrites. Neuronale morfologie is afgebeeld in Figuur 2. - Genereren van filmbestanden.
- Open de multi TIFF-bestand met behulp van Fiji software. Ga vervolgens naar bestand > Open selecteert het meerdere TIFF-bestand opgeslagen in stap 5.4.
Opmerking: Fiji kan worden gedownload op jttps://fiji.sc. Afbeelding J en plugins kan ook worden gebruikt voor het genereren van kymographs. Als daarbij de relevante instructies voor de gekozen plugin. - Klik op de " rechthoekige selectie " knop ( Figuur 3 A, pijl) en selecteer het gebied van belang door het tekenen van een rechthoek met een computermuis (gele rechthoek in Figuur 3 A). Ga naar Image > stapels > Tools > Substacks maken en selecteer de segmentnummers die zijn opgenomen in de film. Een substack wordt gegenereerd.
- Het substack-venster activeren door te klikken op en ga naar afbeelding > aanpassen > Helderheid/Contrast. Een venster naar de helderheid en het contrast aanpassen verschijnt. Schuif in het venster, de top bar (Minimum) naar rechts zodat de achtergrond signaal verdwijnt en de tweede top bar (maximaal) naar links dus dat de bewegende blaasjes en deeltjes kunnen worden gezien heel goed op de achtergrond.
- Ga naar afbeelding > stapels > tijd Stamper. Als de film is opgenomen in de 4 frames/s in stap 5.4, het tijdsinterval is 0,25 s. Dus, typ " 0,25 " in Interval.
- Genereren een filmbestand door opslaan als te kiezen > AVI in het menu bestand (film 1 en 2).
Opmerking: Met behulp van passende plugins, u kunt het bestand opslaan als andere formaten zoals " mpeg4 " of " mov " bestanden.
- Open de multi TIFF-bestand met behulp van Fiji software. Ga vervolgens naar bestand > Open selecteert het meerdere TIFF-bestand opgeslagen in stap 5.4.
- Genereren kymographs.
- Opent u de oorspronkelijke filmbestanden FIji softwarematig opnieuw en herhaal stap 5.6.2 en 5.6.3 aanpassen van de helderheid en het contrast.
- Klik " gesegmenteerde lijn " ( Figuur 3 B, pijl). Met een muis, tekent u een gesegmenteerde lijn langs de cilia of axon (gele lijn, in Figuur 3 B).
- Ga naar analyseren > Multi Kymograaf > Multi-Kymograaf ( Figuur 3 C). Lijn breedte venster verschijnt ( Figuur 3 D). Type " 3 " in het Linewidth venster en klik op OK ( Figuur 3 D).
- Kymograaf venster is gemaakt. Sla de afbeelding in TIFF of JPEG formaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Axonale vervoer in DA9 neuron
Met behulp van de wyIs251 -lijn, zowel de retrograde axonale vervoer van GFP::RAB-3 de anterograde kan tegelijkertijd opgenomen worden in de DA9 motor neuron. De gemiddelde snelheid van anterograde en retrograde vervoer in de proximale dorsale axon van het DA9 neuron is ongeveer 1,8 en 2.6 μm/s, respectievelijk22. Het aantal bewegende blaasjes is ongeveer 0,03 en 0.018 per μm van axon per s. Dus, voor een 30 s waarnemingen van 10 μm van axon van de DA9 met behulp van een 100 x lens, vindt men ongeveer 9 en 5 verplaatsen van blaasjes in het axon (Figuur 4 en film 1). Als geen vesiculaire beweging kan worden waargenomen, is het mogelijk dat de kracht van de laser te zwak is. Naast lange afstand loopt, korte afstand verkeer van vesikel zwembaden kan worden opgenomen (film 1). Sommige blaasjes stoppen bij deze blaasje zwembaden, terwijl anderen van er7,23 distantiëren. Deze parameters kunnen worden gecontroleerd en worden gebruikt voor het analyseren van mutant fenotypen.
IFT in staart neuronen
Cilia zijn gelokaliseerd op het puntje van dendrites in C. elegans (Figuur 2B). De mnIs17 -stam spreekt GFP-gelabeld OSM-6, een van de IFT subeenheden29. OSM-6 wordt uitgedrukt in beide hoofd en staart neuronen19. Terwijl vele hoofd cilia worden aangeduid door mnIs17, worden slechts twee cilia duidelijk waargenomen in de staart neuron. Deze cilia observeren is dus makkelijker dan hoofd cilia (Zie ook bespreking). OSM-6::GFP is in de neuronale cytoplasma zoals die gevonden in de axon, cel lichaam en dendriet diffuus. In de cilia, is OSM-6::GFP echter geconcentreerd op trilharen en opgenomen bij het verplaatsen van deeltjes. De lengte van PHA en PHB cilia zijn ongeveer 6.5 μm. Anterograde IFT is tweefase 8,9. De snelheid van anterograde IFT gaat over 0.7 en 1.3 μm/s in de middelste en distale segmenten van de trilharen, respectievelijk (Figuur 5 en Movie 2).
Figuur 1 : Demonstratie van de monsterverwerking. (A) Hot DW, pipet van Pasteur en 10% agarose op warmte blok. (B en C) Voorbereiding voor agarose pads: een agarose pad wordt gevormd tussen dia's (B). De bovenste dia is verwijderd na een agarose pad vormen (C). (D) Schematische tekening met aanduiding van hoe polystyreen kraal oplossing wordt gelegd op de agarose pad. (E) Schematische tekening toont hoe de wormen worden gebracht in de oplossing van de polystyreen kraal met behulp van een platina draad halen. (F) A dekglaasje aan (22 x 44 mm2) is de agarose pad gezet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Opnamegebied. (A) Schematische tekening van de DA9 en de VA12 neuronen en een representatief beeld van wyIs251. In de DA9 neuronen hoeft de ventrale axon commissuur en de proximale axon niet volwassen synapsen. Maar synaptic vesikel precursoren naar synapsen via deze axonale regio's van de cel lichaam worden vervoerd. De regio die moet worden nageleefd wordt aangegeven door vakken. (B) Schematische tekening van PHA en PHB neuronen en hun cilia. De regio die moet worden nageleefd wordt aangegeven door vakken. Schaal bar = 10 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Productie van films en kymographs met behulp van Fiji software. (A) Klik op de knop "Rechthoekige selectie" (pijl) en selecteer het gebied dat men richten willen zou op door te tekenen van een rechthoek (gele box) voor het genereren van substacks. (B) Klik op de knop van de gesegmenteerde lijn (pijl) en teken een gesegmenteerde lijn langs de trilharen met behulp van een muis (gele lijn). (C) Selecteer "Analyseren", "Multi-Kymograaf" en "Multi-Kymograaf" om te beginnen met een plugin voor het genereren van kymographs. (S) Input linewidth, klik op "OK" en genereren van kymographs (Figuur 5 en Figuur 7). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatieve Kymograaf van axonale vervoer van synaptic vesikel precursoren. GFP::Rab-3 beweging is waargenomen bij de proximale asynaptic regio van DA9 neuron en de Kymograaf werd gegenereerd met Multi-Kymograaf van Fiji. Horizontale en verticale staven lengte en tijd, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Representatieve Kymograaf van IFT. OSM-6::GFP wordt waargenomen in PHA en PHB cilia en deze Kymograaf wordt gegenereerd uit de mensenhandel evenement in één van beide één van hen. De Kymograaf werd gegenereerd met Multi-Kymograaf van Fiji. Horizontale en verticale staven lengte en tijd, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: vertegenwoordiger film van axonale vervoer van synaptic vesikel precursoren. GFP::Rab-3 beweging is waargenomen bij de proximale asynaptic regio van het DA9 neuron. GFP::Rab-3 is opgenomen in synaptic vesikel precursoren en vervoerd. Zowel anterograde en retrograde axonale vervoer worden vastgelegd. Sommige blaasjes stoppen maar opnieuw. De film werd opgenomen in 4 frames/s en speelt op 15 frames/s. ScaLe bar = 5 μm. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Movie 2: vertegenwoordiger film van IFT. OSM-6::GFP wordt waargenomen in PHA en PHB cilia. OSM-6::GFP is geïntegreerd in de complexe IFT en beweegt langs de cilia. De film werd opgenomen in 4 frames/s en speelt op 15 frames/s. schaal bar = 5 μm. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beperking met betrekking tot bestaande methoden
De hier beschreven methode is geoptimaliseerd om te zien hoe snel evenementen zoals axonale vervoer en IFT. Immobilisatie is dus meer prioriteit dan langer incubatie. Terwijl wij kunnen observeren van mensenhandel gebeurtenissen voor ten minste 20 min. zonder aanzienlijke verstoring hebben, deze methode mogelijk niet altijd geschikt voor het observeren van langzame gebeurtenissen waarvoor langere opmerkingen, zoals axon rek en cel migratie. Voor langere opmerkingen, moet men de voorwaarden optimaliseren door het verminderen van het percentage van het agarose (d.w.z., verhoging van het water Voorkom opdrogen en het verminderen van de druk dat mogelijk veroorzaakt schade). Als alternatief, het apparaat van de microfluidic beschreven boven15 of immobilisatie van wormen met behulp van agarose pads en verdoving mogelijk geschikter16 terwijl bijwerkingen moet zorgvuldig worden beoordeeld.
Kritische stappen binnen het protocol
Voor voldoende waarnemingen staan markeringen kritisch tegenover. Markeringen moeten worden opgenomen in de blaasjes of deeltjes en van voldoende helderheid. Extrachromosomal arrays of geïntegreerde lijnen kunnen worden gebruikt. Voor visualisatie van het axonale vervoer van synaptic vesikel precursoren in de DA9 neuronen is de wyIs251 -stam nuttig7,23. jsIs821 is gebruikt om het observeren van axonale vervoer in mechanosensory neuronen in sommige studies26,27. Wanneer andere neuronen worden geanalyseerd, moeten synaptic vesikel eiwitten interesse neuronen met behulp van specifieke initiatiefnemers van de cel worden uitgedrukt. Deze initiatiefnemers moeten sterk genoeg zijn. RAB-3 en SNB-1 worden veel gebruikt op het etiket van synaptic vesikel precursoren22,23,26. Om te observeren IFT, moeten de componenten van de complexe IFT worden aangeduid. Als positieve controle, de mnIs17 stam is is een goede keuze29. Cilia afkomstig uit 8 cellen (ASE, ASG, ASI, ASL, ASH, ASK, ADF en ADL) zijn gebundeld in het hoofd (amphid) terwijl de cilia uit 2 cellen (PHA en PHB) zijn gebundeld in de staart (phasmid). Omdat OSM-6::GFP wordt uitgedrukt in alle ciliated neuronen in mnIs17, kan het moeilijk zijn om de IFT in hoofd cilia in detail analyseren. Echter, in de regio van de staart, enige PHA en PHB neuronen worden aangeduid en IFT in elke cel kan gemakkelijk worden opgelost. Andere IFT eiwitten gelabeld door fluorescente proteïnen kunnen worden gebruikt om te observeren IFT21,28. Als men wil analyseren hoofd neuronen, zou cel-specifieke initiatiefnemers zinvol zijn. Terwijl hoofd cilia verschillende morphologies hebben, kunnen vervoer gebeurtenissen opgenomen29. Door overschrijding van mutanten met deze markeringen, kunnen de functies van alle genen in axonale vervoer en IFT worden geanalyseerd in vivo. De parameters die kunnen worden geanalyseerd zijn beschreven in de vorige werk22,23,26,27. GFP is de beste en primaire keuze. mCherry en tdTomato kunnen ook gebruikte22, echter mCherry is veel minder scherp dan GFP. tdTomato is een tandem-dimeer en groter dan de monomere fluorescerende eiwitten, die soms van invloed op de dynamiek van fusion eiwitten30. Dus de resultaten moeten worden geanalyseerd en geïnterpreteerd voorzichtig wanneer tdTomato wordt gebruikt. mScarlet, een heldere monomeer rode fluorescent proteïne die onlangs zijn ontwikkeld, is een alternatieve keuze31.
Terwijl de draaiende schijf confocale microscopie is gebruikte te observeren axonale vervoer en IFT7,21, de apparatuur is duur en moeilijk te benaderen in sommige omgevingen onderzoek. Deze verschijnselen kunnen echter ook worden opgenomen en geanalyseerd in C. elegans met behulp van standaard fluorescente microscopen, indien uitgerust met hoge nb lenzen, omdat C. elegans is een kleine en transparante dierlijke en eenvoudig te observeren.
Toekomstige toepassing
Door de soortgelijke immobilisatie hier beschreven methode, werd IFT waargenomen bij de resolutie van één molecuul in vivo32. Bovendien, de verschillende soorten Super resolutie microscopie zijn ontwikkeld. Een kunt de hier beschreven super resolutie microscopische analyse methoden direct toepassen. In mijn ervaring, de snelle modus van Airyscan33 werkt erg goed voor het analyseren van IFT. In theorie zou een draaiende schijf super-resolutie Microscoop (SDSRM) een goede keuze als goed34. Kortom, door het combineren van mutant bibliotheken en deze nieuwe technieken, de beschreven methode moet hier zinvol zijn voor de verduidelijking van de moleculaire mechanismen van axonale vervoer en IFT in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteur dankt diep Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) voor haar nuttige discussie. wyIs251 was een gulle gift van Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 werd verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 en #16 H 06536 en Daiichi Sankyo foundation, Brain Science Foundation en Naito Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B.
- Ishikawa, H., Marshall, W. F.
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S.
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
