रीयल-टाइम 3d एकल कण ट्रैकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल
Summary
इस प्रोटोकॉल के निर्माण और एक वास्तविक समय 3 डी एकल कण ट्रैकिंग माइक्रोस्कोप उच्च प्रसार गति और कम फोटॉन गिनती दरों पर नेनो फ्लोरोसेंट जांच पर नज़र रखने में सक्षम का विवरण ।
Abstract
रीयल-टाइम तीन-आयामी एकल कण ट्रैकिंग (RT-3d-SPT) में तेज, सेलुलर सिस्टम में 3d प्रक्रियाओं पर प्रकाश डाला जाने की क्षमता है. हालांकि विभिन्न आरटी-3d-SPT तरीकों को हाल के वर्षों में आगे रखा गया है, कम फोटॉन गणना दरों पर उच्च गति वाले 3d फैलाना कणों पर नज़र रखना एक चुनौती बनी हुई है । इसके अलावा, आरटी-3d-SPT setups आम तौर पर जटिल है और लागू करने के लिए मुश्किल है, जैविक समस्याओं के लिए अपने व्यापक आवेदन सीमित । इस प्रोटोकॉल 3 डी गतिशील फोटॉन स्थानीयकरण ट्रैकिंग (3 डी-DyPLoT), जो उच्च प्रसार गति (अप करने के लिए 20 µm2/कम फोटॉन गिनती दर पर (10 kHz करने के लिए नीचे) के साथ कणों को ट्रैक कर सकते है नामक एक RT-3d-SPT प्रणाली प्रस्तुत करता है । 3 डी-DyPLoT एक 2d इलेक्ट्रो ऑप्टिक झुकानेवाला (2d-ईओडी) और एक स्वरित्र ध्वनिक ढाल (टैग) लेंस एक एकल केंद्रित लेजर स्थान गतिशील रूप से 3 डी में ड्राइव को रोजगार । एक अनुकूलित स्थिति अनुमान एल्गोरिथ्म के साथ संयुक्त, 3 डी-DyPLoT उच्च ट्रैकिंग गति और उच्च स्थानीयकरण परिशुद्धता के साथ एकल कणों पर ताला कर सकते हैं । एकल उत्तेजना और एकल पहचान पथ लेआउट के कारण, 3d-DyPLoT मजबूत और स्थापित करने के लिए आसान है । यह प्रोटोकॉल चर्चा करता है कि 3d-DyPLoT चरण द्वारा चरण कैसे बनाएं । सबसे पहले, ऑप्टिकल लेआउट वर्णन किया गया है । अगले, प्रणाली और तुले है रैस्टर द्वारा अनुकूलित piezoelectric nanopositioner के साथ एक १९० एनएम फ्लोरोसेंट मनका स्कैनिंग । अंत में, वास्तविक समय 3 डी ट्रैकिंग क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, ११० एनएम फ्लोरोसेंट मोती पानी में नज़र रखी हैं ।
Introduction
उंनत इमेजिंग तकनीक के उद्भव के लिए एक खिड़की खोल दिया है कभी सेलुलर घटनाएं, सभी तरह के आणविक स्तर पर नीचे की संरचना अधिक विस्तृत देखें । stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के रूप में तरीके1,2,3, फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम)4,5,6,7 , संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम)8,9,10,11, और प्रेरित उत्सर्जन घट माइक्रोस्कोपी (STED)12,13, 14 दूर विवर्तन सीमा से परे चले गए है संरचना और जीने की कोशिकाओं के समारोह में अभूतपूर्व विस्तार से उद्धार । हालांकि, कैसे इन प्रणालियों व्यवहार की पूरी समझ में गतिशील जानकारी की आवश्यकता है और साथ ही संरचनात्मक जानकारी । ऊपर सूचीबद्ध सुपर संकल्प तरीकों स्थानिक संकल्प और लौकिक संकल्प के बीच एक व्यापार बंद शामिल है, जिसके साथ गतिशील प्रक्रियाओं जांच की जा सकती है लौकिक शुद्धता सीमित । एक विधि जो दोनों उच्च स्थानिक परिशुद्धता और लौकिक संकल्प प्रदान करता है RT-3d-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. यहां, हम पारंपरिक 3d-SPT30 और RT-3d-SPT के बीच एक अंतर आकर्षित करते हैं । पारंपरिक 3d-SPT बस तीन आयामी छवि डेटा (जो या तो एक फोकल माइक्रोस्कोप या एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है की एक समय श्रृंखला की आवश्यकता है सही विंयास दिया) । पारंपरिक 3d-SPT में, कण के निर्देशांक प्रत्येक छवि स्टैक में कण का पता लगाने और एक पथ बनाने के लिए क्रमिक वॉल्यूंस में स्थानों को श्रेणीबद्ध करके डेटा संग्रह के बाद निर्धारित किए जाते हैं । इन विधियों के लिए, अंतिम लौकिक रिज़ॉल्यूशन volumetric इमेजिंग दर द्वारा निर्धारित होता है । फोकल माइक्रोस्कोप के लिए, यह सेकंड के दसियों सेकंड के पैमाने पर आसानी से होता है । epifluorescence तरीकों के लिए, जिसमें ऑप्टिकल पथ इतनी हेर है कि अक्षीय स्थान जानकारी निकाला जा सकता है, लौकिक संकल्प कैमरा जोखिम या readout समय तक सीमित है । इन epifluorescent तरीकों सीमा से अधिक है जो अक्षीय जानकारी एकत्र किया जा सकता है में सीमित हैं, हालांकि हाल ही में प्रगति का रूपान्तर विमान चरण मास्क डिजाइन और अनुकूली प्रकाशिकी इन पर्वतमाला का विस्तार है 10 µm या अधिक31,३२ , ३३ , ३४.
इसके विपरीत, RT-3d-SPT एक 3d छवि स्टैक प्राप्त करने और इस तथ्य के बाद कणों को ढूँढने पर निर्भर नहीं करता है. इसके बजाय, वास्तविक समय स्थान की जानकारी एकल बिंदु डिटेक्टरों के माध्यम से निकाला जाता है और प्रतिक्रिया प्रभावी ढंग से “बंद” एक highspeed piezoelectric मंच के उपयोग के माध्यम से उद्देश्य लेंस के फोकल मात्रा में कण को लागू किया जाता है । यह केवल कितने फोटॉनों एकत्र किया जा सकता द्वारा सीमित कण की स्थिति के सतत माप की अनुमति देता है । इसके अलावा, इस विधि के कण के वर्णक्रम पूछताछ सक्षम बनाता है के रूप में यह लंबी पर्वतमाला पर चलता है । RT-3 डी-प्रभाव में SPT नेनो वस्तुओं के लिए एक बल मुक्त ऑप्टिकल जाल के सदृश काम करता है, जिसमें कण लगातार जांच की है और बड़े लेजर शक्तियों या ऑप्टिकल बलों के लिए आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में मापा जाता है । यह देखते हुए कि RT-3d-SPT तेजी से प्रसार करने वाली वस्तुओं की सतत पूछताछ के लिए एक साधन प्रदान करता है (अप करने के लिए 20 µm2/25,29 पर तीन आयामों में कम फोटॉन गणना दर20,29, ३५, यह intracellular कार्गो परिवहन, ligand रिसेप्टर बाइंडिंग, और एकल virions की extracellular गतिशीलता के रूप में तेजी से या परिवर्तनीय जैविक प्रक्रियाओं में एक खिड़की प्रदान करना चाहिए । हालांकि, इस बिंदु के लिए, RT-3d-SPT के आवेदन इस प्रौद्योगिकी अग्रिम करने के लिए काम कर रहे समूहों की मुट्ठी भर तक ही सीमित किया गया है.
एक बाधा ऑप्टिकल आरटी-3d-SPT तरीकों, जो विविध है द्वारा आवश्यक लेआउट की जटिलता है । अधिकांश विधियों के लिए, ऑप्टिकल प्रतिक्रिया एक piezoelectric चरण द्वारा प्रदान की गई है । कण के रूप में एक्स, वाई, या जेड में छोटे आंदोलनों बनाता है, एकल बिंदु डिटेक्टरों से readouts त्रुटि कार्यों में परिवर्तित कर रहे है और उच्च गति पर खिलाया एक piezoelectric nanopositioner है, जो बारी में नमूना है कण गति प्रतिक्रिया, प्रभावी ढंग से ले जाता है यह उद्देश्य लेंस के सापेक्ष जगह में ताला लगा । एक्स, वाई, और जेड में छोटे स्थिति आंदोलनों को मापने के लिए, या तो एकाधिक डिटेक्टरों (4 या 5 कार्यांवयन के आधार पर)15,18,21 या एकाधिक उत्तेजना स्पॉट (2-4, जिनमें से कम लागू किया जा सकता है अगर एक ताला एम्पलीफायर में एक्स और वाई स्थिति एक घूर्णन लेजर स्थान का उपयोग कर निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है)25,28 लागू होते हैं. इन एकाधिक डिटेक्शन और उत्सर्जन धब्बों के ओवरलैप सिस्टम को संरेखित और बनाए रखना कठिन बनाते हैं ।
इस के साथ साथ, हम एक उच्च गति लक्ष्य-3 डी-DyPLoT29कहा जाता है एक सरलीकृत ऑप्टिकल डिजाइन के साथ 3d-SPT विधि बंद प्रस्तुत करते हैं । 3 डी-DyPLoT एक 2d-ईओडी और एक टैग लेंस का उपयोग करता है३६,३७,३८ गतिशील एक उच्च दर (५० khz XY, ७० khz जेड) पर उद्देश्य फोकल मात्रा के माध्यम से एक केंद्रित लेजर स्थान ले जाने के लिए । लेजर फोकस स्थिति और फोटॉन आगमन के समय के संयोजन है कण 3 डी की स्थिति को तेजी से भी कम फोटॉन गिनती दरों पर प्राप्त करने में सक्षम बनाता है । 2d-ईओडी एक नाइट टूर पैटर्न में लेजर फोकस ड्राइव३९ x-Y विमान और टैग लेंस में 1 x 1 µm के एक वर्ग आकार के साथ 2-4 µm की एक सीमा के साथ अक्षीय दिशा में लेजर ध्यान चलता रहता है । 3 डी कण स्थिति 3 डी में एक अनुकूलित स्थिति अनुमान एल्गोरिथ्म29,४० के साथ प्राप्त की है । 3 डी का नियंत्रण गतिशील चलती लेजर स्पॉट, फोटॉन हिमस्खलन photodiode से गिनती (APD), वास्तविक समय कण स्थिति गणना, piezoelectric मंच प्रतिक्रिया, और डेटा रिकॉर्डिंग एक क्षेत्र प्रोग्राम गेट सरणी (FPGA) पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।इस प्रोटोकॉल में, हम का वर्णन कैसे एक 3d-DyPLoT माइक्रोस्कोप का निर्माण करने के लिए कदम दर कदम, सहित ऑप्टिकल संरेखण, तय कणों के साथ अंशांकन, और अंत में मुक्त कण ट्रैकिंग. एक प्रदर्शन के रूप में, ११० एनएम फ्लोरोसेंट मोती एक समय में मिनट के लिए पानी में लगातार ट्रैक किए गए ।
यहां वर्णित विधि किसी भी आवेदन के लिए एक आदर्श विकल्प है जहां यह लगातार कम प्रकाश स्तर पर एक तेजी से बढ़ फ्लोरोसेंट जांच की निगरानी करना वांछित है, वायरस, नैनोकणों सहित, और बुलबुले जैसे endosomes । पिछले तरीकों के विपरीत, वहां केवल एक एकल उत्तेजना और एकल पहचान मार्ग, बनाने संरेखण और रखरखाव सीधा है । इसके अलावा, बड़े क्षेत्र का पता लगाने के इस माइक्रोस्कोप आसानी से जल्दी से फैलाना कणों लेने के लिए सक्षम बनाता है, जबकि कम संकेत स्तर पर ट्रैक करने की क्षमता (10 kHz करने के लिए नीचे) कम प्रकाश अनुप्रयोगों के लिए इस विधि आदर्श बनाता है29.
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि 3 डी एकल कण ट्रैकिंग तरीकों की कई किस्मों हाल के वर्षों में उभरा है, मजबूत वास्तविक समय उच्च गति 3 डी प्रसार के एक साधारण सेटअप के साथ कम फोटॉन गिनती दरों पर ट्रैकिंग अभी भी एक चुनौती है, जो महत्वपू…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के पुरस्कार संख्या R35GM124868 के तहत और ड्यूक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 2D Electro-optic Deflector | ConOptics | M310A | 2 required |
| Power supply for EOD | ConOptics | 412 | Converts FPGA ouput to high voltage for EOD |
| TAG Lens | TAG Optics | TAG 2.0 | Used to deflect laser along axial direction |
| XY piezoelectric nanopositioner | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in |
| Z piezoelectric nanoposiitoner | MadCity Labs | Nano-OP65HS | Used to move the objective lens to follow the diffusing particle |
| Micropositioner | MadCity Labs | MicroDrive | Used to coarsely position sample and evaluate |
| Objective Lens | Zeiss | PlanApo | High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss |
| sCMOS camera | PCO | pco.edge 4.2 | Used to monitor the particle's position |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | Lower dark counts beneficial |
| Field programmable gate array | National Instruments | NI-7852r | |
| Software | National Instruments | LabVIEW | |
| Tracking excitation laser | JDSU | FCD488-30 | |
| Lens | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| Pinhole | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson Polarizer | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| Half-wave plate | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| Lens | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| Lens | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| Dichroic Mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| Fluorescence Emission Filter | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90 beamsplitter | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| 190 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/9942 | |
| 110 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/10617 | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-545A | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | Thorlabs | DCC1545M | |
| Iris | Thorlabs | SM1D12D | |
| Microscope | Mad City Labs | RM21 |
References
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