Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule
Summary
Détails de ce protocole la construction et l’exploitation d’un microscope de suivi en temps réel 3D seule particule capable de suivi échelle nanométrique fluorescent sondes à grande vitesse par diffusion et taux de comptage de photons de faible.
Abstract
Une seule particule tridimensionnelle en temps réel suivi (RT-3D-SPT) a le potentiel pour faire la lumière sur les processus rapides et 3D dans les systèmes cellulaires. Bien que diverses méthodes de RT-3D-SPT ont été présentés ces dernières années, haute vitesse de suivi 3D diffusant des particules à des taux de comptage de photons de faible reste un défi. En outre, des configurations de RT-3D-SPT sont généralement complexes et difficiles à mettre en œuvre, limitant leur application généralisée aux problèmes biologiques. Ce protocole présente un système de RT-3D-SPT nommé 3D dynamique Photon localisation Tracking (3D-DyPLoT), qui permet de suivre les particules à haute vitesse par diffusion (jusqu’à 20 µm2/s) au taux de comptage de photons de faible (jusqu’à 10 kHz). 3D-DyPLoT emploie un déflecteur d’electro-optiques 2D (2D-EOD) et une lentille de gradient acoustique accordable (TAG) d’entraînement axé sur un seul laser spot dynamiquement en 3D. Combiné avec un algorithme d’estimation de position optimisée, 3D-DyPLoT pouvez verrouiller sur les particules unique avec suivi haute vitesse et la précision de localisation haute. En raison de l’excitation unique et mise en page de chemin d’accès détection simple, 3D-DyPLoT est robuste et facile à mettre en place. Ce protocole décrit comment construire 3D-DyPLoT étape par étape. Tout d’abord, la disposition optique est décrite. Ensuite, le système est calibré et optimisé par une perle fluorescente de 190 nm avec la NANOPOSITIONNEUR piézoélectrique de balayage. Enfin, pour illustrer la 3D en temps réel suivi de capacité, 110 perles fluorescentes nm sont suivis dans l’eau.
Introduction
L’émergence des techniques avancées d’imagerie a ouvert une fenêtre pour visualiser la structure toujours plus détaillée des phénomènes cellulaires, tout le chemin jusqu’au niveau moléculaire. Méthodes telles que la reconstruction optique stochastique microscopie (tempête)1,2,3, localisation photoactivation microscopie (PALM)4,5,6,7 , structurée illumination microscopie (SIM)8,9,10,11et a stimulé des émissions appauvrissement microscopie (STED)12,13, 14 ont largement dépassé la limite de diffraction à livrer des détails sans précédent dans la structure et la fonction des cellules vivantes. Toutefois, complète compréhension de la façon dont ces systèmes comportent nécessite des informations dynamiques ainsi que des informations structurelles. Les méthodes de Super-résolution énumérés ci-dessus impliquent un compromis entre la résolution spatiale et résolution temporelle, limitant la précision temporelle avec laquelle les processus dynamiques peuvent être sondées. Une méthode qui fournit la haute précision spatiale et la résolution temporelle est RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Ici, nous font une distinction entre les traditionnelles 3D-SPT30 et traditionnel de RT-3D-SPT. 3D-SPT nécessite simplement une série chronologique de données d’images en trois dimensions (ce qui peuvent être acquis soit à l’aide d’un microscope confocal ou un microscope à épifluorescence compte tenu de la configuration de droite). Dans traditionnel 3D-SPT, les coordonnées de la particule sont déterminées après la collecte de données en recherchant la particule dans la pile de chaque image et en concaténant les emplacements dans les volumes successifs pour créer une trajectoire. Pour ces méthodes, l’ultime résolution temporelle est déterminée par le taux d’imagerie volumétrique. Pour les microscopes confocaux, c’est facilement sur l’échelle de secondes à quelques dizaines de secondes. Pour les méthodes épifluorescence, dans laquelle le chemin optique est manipulé afin que les informations d’emplacement axial peuvent être extraite, la résolution temporelle est limitée par le temps d’exposition ou l’affichage de caméra. Ces méthodes épifluorescente sont limitées à la plage sur laquelle axiales renseignements peuvent être recueillis, bien que les progrès récents dans la phase de plan de Fourier masques conception et optique adaptative étend ces gammes de 10 microns ou plus31,32 , 33 , 34.
En revanche, le RT-3D-SPT ne dépend pas acquérir une pile d’images 3D et de trouver des particules après coup. Au lieu de cela, localisation en temps réel les informations est extraites par l’intermédiaire de détecteurs monopoint et rétroaction est appliquée à efficacement « verrouiller » la particule du volume focal de l’objectif grâce à l’utilisation d’un stade piézoélectrique highspeed. Cela permet une mesure continue de la position de la particule limitée seulement par le nombre de photons peuvent être collectées. En outre, cette méthode permet interrogatoire spectrale de la particule lorsqu’elle se déplace sur de longues plages. RT-3D-SPT en vigueur oblige de travaux s’apparente à un piège optique sans force pour objets nanométriques, dans lequel la particule est continuellement sondée et mesurée en temps réel sans nécessiter de grandes puissances ou optique. Étant donné que RT-3D-SPT fournit un moyen de l’interrogatoire continu des objets vite diffusif (jusqu’à 20 µm2/s),25,29 en trois dimensions à photon faible nombre taux20,29, 35, elle devrait fournir une fenêtre dans les processus biologiques rapides ou transitoires tels que le transport intracellulaire de marchandises, liaison ligand-récepteur et la dynamique extracellulaire des virions unique. Toutefois, à ce stade, l’application de la RT-3D-SPT a été limitée à la poignée de groupes de travail pour faire progresser cette technologie.
Un des obstacles sont la complexité de la mise en page optique requis par les méthodes de RT-3D-SPT, qui sont variés. Pour la plupart des méthodes, la rétroaction optique est fournie par un stade piézoélectrique. Comme les mouvements petite particule fait à X, Y, ou Z, lectures de détecteurs monopoint sont converties en fonctions de l’erreur et nourris à haute vitesse à un NANOPOSITIONNEUR piézoélectrique, qui en déplace l’échantillon pour contrer efficacement les mouvement de la particule, verrouillant en place par rapport à l’objectif. Pour mesurer les petits mouvements de positions x, Y et Z, soit plusieurs détecteurs (4 ou 5 selon la mise en œuvre)15,18,21 , soit plusieurs spots d’excitation (2-4, la partie inférieure qui peut être appliquée si un amplificateur à verrouillage est utilisé pour extraire des X et position Y en utilisant une rotation laser spot)25,28 s’appliquent. Le chevauchement de ces taches de détection et d’émission multiples compliquent les systèmes à aligner et à entretenir.
Ici, nous présentons une méthode de verrouillage de cible à grande vitesse 3D-SPT avec un design optique simplifié appelé 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utilise un 2D-EOD et un TAG lentille36,37,38 pour déplacer dynamiquement une tache laser focalisé dans le volume focal objective à un rythme élevé (50kHz XY, 70kHz Z). Combinant la position de foyer de laser et de l’heure d’arrivée de photon permet la position 3D de la particule à obtenir rapidement même au taux de comptage de photons de faible. 2D-jeo actionne la mise au point du laser à tour modèle39 avec une taille de carrés de 1 x 1 µm dans le plan X-Y un chevalier et l’objectif de TAG déplace le focus de laser dans le sens axial avec une plage de 2 à 4 µm. La position de la particule 3D est obtenue avec une estimation de position optimisée algorithme29,40 en 3D. Le contrôle du 3D dynamique mouvement laser spot, photon de l’avalanche photodiode (APD), calcul de position de la particule en temps réel, retour de scène piézoélectrique et enregistrement des données sont exécutées sur un field programmable gate array (FPGA).Dans ce protocole, nous expliquent comment construire un microscope 3D-DyPLoT étape par étape, y compris un alignement optique, étalonnage avec particules fixes et enfin libre suivi de particules. Comme une démonstration, 110 perles fluorescentes nm ont été suivis en permanence dans l’eau pour les minutes à la fois.
La méthode décrite ici est un choix idéal pour n’importe quelle application où il est souhaitable de suivre en permanence une sonde fluorescente se déplaçant rapidement à des niveaux faibles de lumière, y compris les virus, les nanoparticules et vésicules comme des endosomes. Contrairement aux méthodes précédentes, il n’y a qu’une seule excitation et la voie de détection unique, ce qui rend simple alignement et entretien. En outre, la zone de détection grande permet ce microscope ramasser facilement diffuser rapidement les particules, tandis que la capacité de suivre les niveaux de signal faible (jusqu’à 10 kHz) rend cette méthode idéale pour les applications de basse lumière29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que beaucoup de variétés de particule unique 3D, méthodes de suivi est apparues ces dernières années, robuste suivi en temps réel de diffusion 3D haute vitesse au taux de comptage de photons de faible avec une simple configuration est encore un défi, qui limite son application aux important biologique problèmes. La méthode 3D-DyPLoT décrit dans cette adresses ces défis de plusieurs façons. Tout d’abord, les voies de l’excitation et la détection sont simplifiés grandement par rapport aux autres impl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous le numéro R35GM124868 de la sentence et de Duke University.
Materials
| 2D Electro-optic Deflector | ConOptics | M310A | 2 required |
| Power supply for EOD | ConOptics | 412 | Converts FPGA ouput to high voltage for EOD |
| TAG Lens | TAG Optics | TAG 2.0 | Used to deflect laser along axial direction |
| XY piezoelectric nanopositioner | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in |
| Z piezoelectric nanoposiitoner | MadCity Labs | Nano-OP65HS | Used to move the objective lens to follow the diffusing particle |
| Micropositioner | MadCity Labs | MicroDrive | Used to coarsely position sample and evaluate |
| Objective Lens | Zeiss | PlanApo | High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss |
| sCMOS camera | PCO | pco.edge 4.2 | Used to monitor the particle's position |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | Lower dark counts beneficial |
| Field programmable gate array | National Instruments | NI-7852r | |
| Software | National Instruments | LabVIEW | |
| Tracking excitation laser | JDSU | FCD488-30 | |
| Lens | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| Pinhole | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson Polarizer | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| Half-wave plate | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| Lens | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| Lens | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| Dichroic Mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| Fluorescence Emission Filter | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90 beamsplitter | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| 190 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/9942 | |
| 110 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/10617 | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-545A | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | Thorlabs | DCC1545M | |
| Iris | Thorlabs | SM1D12D | |
| Microscope | Mad City Labs | RM21 |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).
- Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
- Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
- Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184, 359-379 (2015).
- Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
- Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
- Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).
- Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
- Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
- Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
- McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
- McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
- McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
- Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
- Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
- Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
- Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
- Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
- Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
- Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).
- Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
- Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
- Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606 (2017).
- Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
- Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
- Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
- Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
- Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
