Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral
Summary
Neste relatório, destacam-se as vantagens de organotypic culturas e culturas primárias dissociadas dos gânglios das raízes de dorsais do mouse-derivado para investigar uma ampla gama de mecanismos associados a interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e resposta à infecção viral.
Abstract
Este protocolo descreve um modelo ex vivo de rato-derivado de raiz de dorsal gânglio (DRG) explante e in vitro DRG-derivado co-cultura de neurônios sensoriais dissociados e células gliais do satélite. Estes são modelos útil e versátil para investigar uma variedade de respostas biológicas, associados a condições fisiológicas e patológicas do sistema nervoso periférico (SNP) variando de interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e infecção viral. O uso de explant DRG é cientificamente vantajoso em relação aos modelos de células únicas simplista, por várias razões. Por exemplo, como uma cultura de organotypic, o explante DRG permite transferência ex vivo de toda uma rede neuronal incluindo o microambiente extracelular que desempenham um papel significativo em todas as funções neuronais e gliais. Além disso, DRG explantes também podem ser mantidas ex vivo por vários dias e as condições de cultura podem ser perturbadas como desejado. Além disso, a DRG colhido pode ser dissociado ainda mais em uma em vitro co-cultura de neurônios sensoriais primários e células gliais satélites para investigar a interação neuronal-gliais, neuritogenesis, interação de cone axonal com o extracelular microambiente e mais geral, qualquer aspecto associado com o metabolismo neuronal. Portanto, o sistema de DRG-explante oferece uma grande flexibilidade para estudar uma grande variedade de eventos relacionados às condições biológicas, fisiológicas e patológicas em uma maneira cost-effective.
Introduction
Neste manuscrito, relatamos um método para obter um modelo ex vivo de organotypic de um sistema de modelo DRG rato derivado como um microambiente de tecido-como preservado para investigar uma ampla gama de respostas biológicas aos insultos PNS variando de neurônio-glia interação, neuroplasticidade, marcadores inflamatórios, a infecção viral. Além disso, temos desenvolvido um protocolo para criar uma cultura co primária de neurônios sensoriais único DRG-derivado e células satélites.
A DRG são cinza-matéria-unidades-satélites localizadas fora do sistema nervoso central (CNS) junto as raízes na espinha dorsais dos nervos espinhais. A DRG, localizado nas proximidades do Forame intervertebral, casa pseudounipolar neurônios sensoriais e por satélite células gliais. Os neurônios pseudounipolar apresentam um único axônio que se divide em um processo periférico transportando insumos somáticos e viscerais de alvos periféricos para o corpo celular e um processo central que envia informações sensoriais do corpo celular para o CNS. Uma cápsula Conectiva define e isola este aglomerado periférico de neurônios e células gliais do SNC. Sem migração celular pós-natal para ou a partir da DRG já foi descrita e um nicho de células-tronco local é responsável por neurogênicos eventos que ocorrem ao longo da vida1. Portanto, este modelo é particularmente adequado para estudar a neurogénese adulta, axonogênese, resposta a lesão traumática e célula morte2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
No campo das Epilepsias, DRG colhidos na vivo e explantados em vitro reproduz axoniotmese, uma condição de lesão na quais axônios são totalmente cortados e o corpo celular neuronal é desconectada o alvo inervado10 ,11. É sabido que lesão de nervo periférico pode causar aumento e diminuição da expressao em DRG e muitas destas alterações são resultado de processos regenerativos, mas muitos também podem ser um resultado da resposta imune ou outra resposta de células não-neuronais. Usando um ex vivo sistema de DRG isolada, um pouco dessa complexidade é removido e vias mecanicistas podem ser investigadas mais facilmente.
Além de seu papel central na transmissão de entradas sensoriais ao SNC, a abundância de receptores para muitos neurotransmissores incluindo GABA12,13,14,15 a nível do soma neuronal, bem como provas de interneuronal Cruz-excitação podem sugerir que DRG são sofisticados integradores preliminares de entradas sensoriais16,17. Estas novas descobertas conferem ao explante DRG as características de um sistema de rede mini-neuronal semelhante a outros modelos de “mini cérebro”, que são organoids nervoso-tecido-específica usada para campos experimentais mais amplos de investigação e terapêutica abordagem de doenças neurológicas18,19. Estas evidências juntamente com o facto do DRG um cluster discreto e bem definido de tecido neuronal, rodeado por uma cápsula conectiva, torná-lo um órgão apropriado para transplante ex vivo .
Rato de cultivo DRG apresenta uma opção atraente multicelular para modelar pathophysiologies humanos devido às similaridades estruturais e genéticas entre as espécies. Além disso, um grande repositório de cepas de rato transgénico é muito propício para futuros estudos mecanicistas. Extensão do axônio tanto durante o desenvolvimento e após lesão requer interações mecânicas entre crescimento cone e substrato20,21. Substratos nano e microcom estampas têm sido usados como ferramentas para direcionar a consequência natural do axônio e demonstrar a sua capacidade para responder às características topográficas no seu microambiente. Os neurônios foram mostrados para sobreviver, aderir, migrar e orientar seus axônios para navegar características de superfície tais como sulcos em substratos22,23. No entanto, estes estudos utilizaram tipicamente linhas de células cultivadas e é difícil prever como neuronal primária as células irá responder às sugestões bem definidas e física na vivo ou ex vivo.
O modelo ex vivo explante de rato DRG usado para esta proposta imita a interação célula-célula real e bioquímicas sugestões em torno de axônios crescentes. Entre muitos diferentes paradigmas experimentais variando de regeneração axonal, produção de neurosphere, a neuroinflammation, a DRG explant modelo continua a servir como uma valiosa ferramenta para investigar o aspecto de latência e infecção viral dentro sensorial gânglios24,25,26,27.
Sistema nervoso (NS) em geral é alvo para infecções virais28,29,30. A maioria dos vírus infectam superfícies de células epiteliais e endoteliais e fazer o seu caminho desde a superfície do tecido para o NS através de nervo periférico fibras sensoriais e motoras. Em particular, o vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) após uma infecção inicial nas células epiteliais estabelece uma latência ao longo da vida nos gânglios sensoriais, de preferência, a DRG da PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacidade de infectar o PNS acaba por conduzir a doenças neurológicas33.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo ex vivo DRG é extremamente útil para investigar um amplo espectro de eventos tais como interação neurônio-glia, bem como o efeito do microambiente em ambos do metabolismo neuronal e glial37. Além disso, a DRG-modelo poderia ser usado como uma ferramenta de baixo custo para abordar questões relevantes referentes ao mecanismo de patogenicidade e associado a marcadores desenvolvendo ex vivo sistemas para fase aguda de crônica e latente da infecção, ou em uma deter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos sinceramente o Imaging-facilidade do núcleo na Universidade do centro-oeste (UTH) e o grupo de estudantes [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo e Casey Sigerson] por suas contribuições no trabalho de imagem e cultura de células. Este trabalho de pesquisa foi apoiado pelo UTH intramuros conceder financiamento para fundos de start-up M.F. e pesquisa para V.T.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. 신경과학. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. 신경과학. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. 신경과학. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A., McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Whitley, R., Kimberlin, . D. W., Prober, C. G., Arvin, A., et al. . Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
