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암 연구학

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

Published: June 16, 2018
doi:
10.3791/56761
, , , , , ,
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine,National Cheng Kung University, 3Trauma Office,Children’s National Health System

Summary

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

Abstract

전이 암 사망의 주요 원인입니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이, 폐 식민 CTCs에 의해 비판적으로 공헌 한다 폐 전이성 프로세스 초기에 홍보에 역할을 적극적으로 조사 되었습니다. 따라서, 동물 모델은 유일한 접근 전이의 전체 조직의 프로세스를. 우리는 vivo에서 폐 식민 분석 결과 설립 문제가 혈관 넘쳐 흐름 CTCs의 기여를 조사 하기 위한 이전 실험 설계에서 발생, 그 긴 장기 형광 세포 추적 프로그램, carboxyfluorescein 그리고 에스테 르 succinimidyl (CFSE), 일시 중단 된 종양 세포를 사용 폐 관류 폐 제거, confocal 영상 및 정량화 이전 비 특히 갇혀 CTCs를 수행 했다. CTC 표면에 고분자 fibronectin (polyFN) 전이성 종양 조직의 최종 설립에 폐 식민 중재 발견 되었습니다. 여기, 특히 polyFN 어셈블리 CTCs에 폐 식민 넘쳐 흐름의 요구 사항을 테스트, 단기 수행 있는 폐 식민 분석 실험 중단 루이스 폐 암 세포 (LLCs) 안정적으로 FN-shRNA (shFN)를 표현 하거나 출 격-shRNA (shScr)와 20 미리 레이블이 CFSE의 μ M C57BL/6 쥐로 정 맥 주사 했다. 우리는 성공적으로 마우스 폐를 식민지로 shFN LLC는 세포의 능력 shScr LLC 셀에 비해 현저 하 게 점감 되었다 설명 했다. 따라서,이 단기 방법론 특히 식민지 폐 순환 내 CTCs의 능력을 보여 주기 위해 널리 적용할 수 있습니다.

Introduction

전이 암 죽음1,2의 주요 원인입니다. 기본 조직에서 파생 하는 종양 세포에에서 순환을 입력 하 고 전에 그들은 다양 한 hematogenous 도전, 예를 들면, anoikis, 면역 공격, 및 혈압 또는 기하학적 구속 조건에서 전단 응력으로 인해 손해 생존 식민지 먼 장기 전이3,4,,56의 성공을 지시 된 중요 한 단계를 수 있습니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 특성화 및 종양 악성 종양, 전이, 암 환자7,8 의 생존 율과 이러한 특성을 상호 활발 한 노력에 현재 되었습니다 따라서, , 9. 암 전이의 과정 vivo에서 이벤트를 구체적으로 묘사, 동물 모델은 유일한 접근 전이10,11,12의 전체 조직의 프로세스를 .

CTCs 먼 장기1,2의 식민지를 포함 하 여 여러 개의 셀룰러 이벤트를 통해 전이성 종양 조직 된다. 그러나, 가장 일반적으로 사용 되 전이 분석 실험13,,1415 먼 장기의 CTC 식민지를 관찰 하는 방법을 제공 하지 않습니다. 따라서,는 vivo에서 분석 결과 디자인 CTC 식민 시각화에 대 한 긴급 하 게 필요 합니다. 하지만 여러 vivo에서 비보 전 짧은 기간 폐 식민 분석 실험 설계 되었습니다, 문제 및 단점 남아 있습니다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP) 동안-overexpressing 종양 세포에서 사용 된 분석 실험22,23, 안정적 transfect 아래에서 충분 한 GFP 형광 강도 종양 세포를 복제 하는 시간이 걸립니다 현미경입니다. 마찬가지로, 비록 GFP 표현 종양 세포를 대체 하 긴 기간 셀 추적 CFSE와 종양 세포의 얼룩 과도 고용 된 남아 CFSE 표시 된 종양 세포 부착 여부를 판단 하기 어렵거나 단지 내 존재는 삭제 먼 장기16,17의 맥 관 구조.

CTCs의 표면에 고분자 fibronectin (polyFN) 전이성 종양 조직18,,1920,21,22의 마지막 설립에 비판적으로 기여할 발견 되었습니다. . 여기, 우리가 수행 단기 폐 식민 분석 실험 중단된 루이스 폐 암 셀 (LLCs)에서 안정적으로 표현 하는 FN-shRNA (shFN) 또는 출 격-shRNA (shScr) 고 미리 CFSE와 C57BL/6 쥐로 정 맥 주사 했다. 2-3 일 후, 마우스 폐 처음 confocal 현미경 검사 법 및 폐 식민지 LLCs의 정량화를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)를 완전히 복종 되기 전에 맥 관 구조 내에서 연결 되지 않은 CTCs 제거와 함께 끼얹는다 했다. 우리가 명확 하 게 보여주었다 폐 식민지 shFN LLCs의 숫자와 종양 혹 shScr LLCs, 실질적으로 식민과 CTCs에의 성장 촉진에 CTCs에 polyFN 어셈블리의 역할을 확실 한지 알아보는 비해 크게 감소 했다 그는 폐입니다. 우리의 연구 영장 추가 암 전이에서 polyFN의 역할에 대 한 조사.

Protocol

모든 실험 쥐에 우리의 연구소 (관리 및 실험 동물의 사용, NCKU 의학 대학에 대 한 가이드)의 지침에 따라 수행 했다. 1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비 시작 하기 전에 실험 프로토콜, 메 마른 외과 봉합, 1 mL 주사기 26 G/0.5 c m 바늘 (대 한 꼬리 정 맥 주사), 얻을 3 mL 주사기 24 G/3 c m 바늘 (대 한 폐 관류), Dulbecco의 수정이 글 미디어 (DMEM), 트립 신-EDTA 솔루션 (5 g/L 트립 신 ?…

Representative Results

Vivo에서 폐 식민 분석 결과 수행 하기 전에 일시 중단 된 종양 세포에 polyFN 중재 폐 식민지 그리고/또한 전이, 촉진에 넘쳐 흐름 여부를 테스트 하려면 그림 1A 에서 볼 수 있듯이 우리가 먼저 적정 다른 CFSE, 세포 투과성 covalently 세포내 포함 하는 아민 분자26,27 일시 중단 된 종양 세포에 변화 하 고 꽤…

Discussion

긴 기간 폐 식민 분석 실험, 단기 우리 고용 여기 먼 장기에 폐 식민 CTCs에 의해 vivo에서 평가 하는 방법론 명확 하 게 발표 하 고 식민지에서 CTCs에 조립 하는 polyFN의 특정 역할 분화와 함께 폐에 넘쳐 흐름 및 전이성 프로세스18,19,,2021다음 주도. 비록 장기 셀 추적기 CFSE 3 일전 폐 관류에 대 한 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 박사 Ming 분 장 및 양 나중 Hsin 쳉 그들의 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품만 사역의 과학 및 기술에 의해 지원 되었다 (대부분-103-2325-B-006-009, 대부분-104-2325-B-006-001, 대부분-105-2325-B-006-001, 및 MOST-106-2320-B-006-068-MY3)의 보건 및 복지 (MOHW106-TDU-B-211-144004). 우리는 또한 그들의 다 광자 공초점 현미경에 대 한 국립 쳉 쿵 대학, 의학 대학의 핵심 연구소에서 지원에 대 한 감사.

Materials

Material
Bovine Serum Albumin (BSA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-9048-46-8
Bouin's Fluid MCC(medical chemical corporation)/POISON 456-A-1GL
CFSE Proliferation Dye ebiosciences 65-0850-85 Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)  (Gibco)ThermoFisher Scientific 12100-061
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-6381-92-6 For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) 
Fetal bovine serum (FBS) (Gibco)ThermoFisher Scientific 10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC) ATCC, Manassas, VA, USA CRL-1642
L-Glutamine, USP  (Gibco)ThermoFisher Scientific 21051-024
Potassium chloride (KCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7447-40-7 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7778-77-0 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )
Sodium chloride (NaCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7647-14-5 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-10039-32-4 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )
Trypan Blue Sigma Aldrich T6146 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS
Trypsin Sigma Aldrich T4799 For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )
Zoletil 50 Virbac To dilute with 1X PBS 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420 KUBOTA Co. 2420
Culture dish (6cm) Wuxi NEST Biotechnology Co. 705001
Disposable syringe (with needle) Perfect Medical Industry Co. 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixer C.T.I YOUNG CHENN TS-20 For suspended cells recovery 
FACSCalibur (FACS) BD biosciences
Forceps Dimeda 10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc. HEPA CLASS 100
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) Stoelting 51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI Olympus FV1000MPE
Neubauer counting chamber Marienfeld-Superior 640010
Surgical scissor Dimeda 08.370.11
Surgical sutures  UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. NO. 0034 Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifuge tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001
15 mL Greiner tube Greiner bio-one 188271
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References

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Lin, T., Liao, Y., Chang, W., Yang, C., Cheng, L., Cheng, M., Cheng, H. The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues. J. Vis. Exp. (136), e56761, doi:10.3791/56761 (2018).
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