In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers
Summary
Deze nieuw ontwikkelde fluorescentie gebaseerde technologie kan op lange termijn van de transcriptie van de circadiane klok genen in de suprachiasmatic kern (SCN) vrij bewegen muizen in real time en met een hoge temporele resolutie.
Abstract
Deze techniek combineert optische vezel gemedieerde fluorescentie opnamen met de nauwkeurige levering van recombinante adeno-associated virus gebaseerd gene verslaggevers. Dit nieuwe en makkelijk te gebruiken in vivo fluorescence bewakingssysteem is ontwikkeld om het opnemen van het transcriptionele ritme van het klok gen, Cry1, in de suprachiasmatic kern (SCN) van vrij bewegende muizen. Om dit te doen, is een Cry1 transcriptie fluorescentie verslaggever ontworpen en verpakt in Adeno-associated virus. Gezuiverde en geconcentreerde virus werd geïnjecteerd in de muis SCN gevolgd door het inbrengen van een optische vezel, die vervolgens werd vastgesteld op het oppervlak van de hersenen. De dieren waren keerde terug naar hun huis kooien en een 1-maand postoperatief herstel periode om voldoende verslaggever expressie. Fluorescentie werd vervolgens opgenomen in vrij verplaatsen van muizen via een in vivo monitoringsysteem dat werd gebouwd op onze instelling. Voor de in vivo opname-systeem, ging een 488 nm laser gepaard met een 1 × 4 beam-splitter die het licht in de vier uitgangen van de excitatie van de laser van gelijke macht verdeeld. Deze instelling ingeschakeld ons tegelijk opnemen van vier dieren. Elk van de signalen uitgezonden fluorescentie werd verzameld via een fotomultiplicator en een data-acquisitie kaart. In tegenstelling tot de vorige bioluminescentie in vivo circadiane klok opname techniek, deze fluorescentie in vivo opname-systeem mag de opname van de circadiane klok genexpressie tijdens de lichte cyclus.
Introduction
Bij zoogdieren regelt de suprachiasmatic kern (SCN) van het hele lichaam circadiane ritme te coördineren van iemands reactie op exogene veranderingen in het milieu (bijvoorbeeld, licht, temperatuur, stress, etc.)1. De componenten van de klok van de kern bestaat uit Per1-3, Cry1-2, kloken Bmal1, en een centrale rol bij het reguleren van de circadiane klok van elke cel. Elke cel in de SCN bevat de transcriptionele activator, klok/BMAL1, die als een heterodimer fungeert voor het opwekken van de expressie van PER en huilen. De PER / CRY complex dan remt de functie van klok/BMAL1 om te vormen van een transcriptie-vertaling feedback lus waarmee ongeveer 24 h naar complete2,3.
Eerdere studies over de SCN hebben voornamelijk werkzaam voor de ex vivo SCN segment cultuur methode4,5,6 en, terwijl deze aanpak waardevolle informatie heeft verstrekt, zijn beperkingen ons vermogen om te hebben geremd het verkrijgen van gegevens betreffende de invloed van andere kernen van de hersenen op de SCN, evenals het effect van exogene stimuli (zoalslicht) op cellen die woonachtig zijn in deze belangrijke regio. In 2001 was Hitoshi Okamura de groep de eerste die de Bioluminescentie systeem in vivo monitor circadiane klok genexpressie gebruiken in de SCN in muizen7vrij te verplaatsen. Ken-ichi Honma de groep heeft doorgebracht de afgelopen jaren verdere ontwikkeling van de Bioluminescentie in vivo opname-systeem in de SCN8,9,10. Samen, hebben deze studies voorzien van onderzoekers de mogelijkheid om te controleren van de circadiane klok in constante duisternis of na een lichte puls. Echter omdat bioluminescentie ook dim te voorzien in continue monitoring tijdens de licht/donker cyclus, in combinatie met het feit dat licht het overheersende signaal nodig zijn voor de SCN-gemedieerde meevoeren van circadiane klokken11 is, is er toenemende vraag naar de ontwikkeling van experimentele methoden die overwinnen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan bioluminescentie opname. Het huidige verslag beschrijft een fluorescentie-gebaseerd systeem dat werd gebouwd om te controleren van de circadiane klok van de SCN in vivo in vrij bewegende muizen. Deze easy-to-use methode toelaat continue monitoring tijdens de licht/donker cyclus en zorgt voor de lange termijn waarneming van de transcriptie van de circadiane klok genen in de SCN in real-time en hoge temporele resolutie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In tegenstelling tot ex vivo methoden, zoals segment cultuur4,5, RT-PCR16en in situ hybridisatie17, die vereisen dat de dieren worden gedood, de in vivo methode opnemen kunt onderzoekers bestuderen circadiane genexpressie in een levend dier. Als zodanig is deze technologie biedt de mogelijkheid om te evalueren van het effect van verschillende fysieke verstoringen (b.v., slaaptekor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden in het lab Zhang voor het verstrekken van discussies en leden in het lab Zhan te stimuleren om technische bijstand te verlenen. Dit onderzoek werd gesteund door subsidies 31500860 (met C.Z.) van het NSFC, 2012CB837700 (om E.E.Z. en C.Z.) van het 973 programma van de M.O.S.T. van China, en door financiële middelen van de gemeentelijke overheid van Peking. E.E.Z. werd gesteund door de Chinezen “Recruitment programma van Global Youth deskundigen”.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
