אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים
Summary
טכנולוגיה זו מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית פיתח ‘ מאפשר ניטור לטווח ארוך של שעתוק של גנים שעון היממה העל-תצלובתי (SCN) לנוע בחופשיות עכברים בזמן אמת, ברזולוציה הטמפורלית גבוהה.
Abstract
טכניקה זו משלבת סיב אופטי מתווכת הקלטות זריחה עם מסירה מדויקת של וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים, המבוסס על ג’ין כתבים. חדש, קל לשימוש ויוו פלורסצנטיות ניטור מערכת זו פותחה להקליט את הקצב תעתיק של הגן השעון, Cry1, העל-תצלובתי (SCN) לנוע בחופשיות עכברים. לשם כך, כתב פלורסצנטיות שעתוק Cry1 היה מתוכנן ונארז לתוך וירוס Adeno-הקשורים. מזוכך, מרוכז וירוס היה מוזרק העכבר SCN ואחריו את ההוספה של סיבים אופטיים, שהיה אז מקובע על גבי המשטח של המוח. החיות היו חזר לכלובים הביתה והתירו את תקופת ההחלמה שלאחר הניתוח חודש להבטיח ביטוי עיתונאי מספיק. קרינה פלואורסצנטית נרשמה ואז לנוע בחופשיות עכברים באמצעות יישום ויוו ניטור המערכת אשר נבנה במוסד שלנו. עבור ה- ויוו למערכת ההקלטה, 488 ננומטר לייזר היה יחד עם 1 × 4 קרן-מפצל זה מחולק האור ארבע יציאות עירור לייזר של כוח שווה. תוכנית התקנה זו אפשרה לנו להקליט מתוך ארבע חיות בו זמנית. כל אחד האותות פלורסצנטיות הנפלט נאסף באמצעות צינור האופטיקה וכרטיס רכישת נתונים. לעומת זאת כדי הקודם ביולומינסנציה ויוו שעון היממה הקלטה הטכניקה, קרינה פלואורסצנטית זה ויוו למערכת ההקלטה מותר את ההקלטה של ביטוי גנים שעון היממה במהלך מחזור אור.
Introduction
ביונקים, העל-תצלובתי (SCN) מושלת שעון ביולוגי בכל הגוף לתאם של הפרט בתגובה שינויים סביבתיים אקסוגני (למשל, אור, טמפרטורה, לחץ, וכו ‘)1. רכיבי שעון הליבה מורכבת Per1-3, Cry1-2, שעוןו- Bmal1, תפקיד מרכזי בוויסות השעון היממה של כל תא. כל תא ב- SCN מכיל activator תעתיק, שעון/BMAL1, אשר משמש heterodimer לזירוז הביטוי של פי ולבכות. פי / מתחם לבכות ואז מעכב את הפונקציה של השעון/BMAL1 ליצירת לולאת משוב תרגום תמלול שלוקח בערך 24 שעות כדי להשלים2,3.
מחקרים קודמים ב- SCN בעיקר המועסקים שמחוץ SCN פרוסה תרבות שיטה4,5,6 , ואילו גישה זו סיפקה מידע רב-ערך, המגבלות יש עכבות היכולת שלנו לקבל נתונים לגבי ההשפעה של אחרים גרעינים במוח ב- SCN, כמו גם השפעת גירויים אקסוגני (למשל, אור) על תאים המתגוררים באזור קריטי זה. בשנת 2001, הקבוצה של היטושי אוקמורה היה הראשון להשתמש למערכת ביולומינסנציה ויוו ביטוי גנים צג שעון היממה SCN במעבר בחופשיות עכברים7. הקבוצה של קן-איצ’י Honma בילה כמה שנים נוספות לפתח את ביולומינסנציה ויוו למערכת ההקלטה ב- SCN8,9,10. יחד, מחקרים אלה סיפקו לחוקרים את היכולת לנטר את שעון היממה בחשכה קבוע או אחרי דופק אור. עם זאת, מכיוון ביולומינסנציה מעומעם מדי כדי לאפשר ניטור רציף במהלך המחזור/כהה, בשילוב עם העובדה כי אור היא האות הדומיננטית הדרושות את entrainment בתיווך SCN של שעונים היממה11, יש הגדלת הביקוש לפיתוח שיטות נסיוניות אשר להתגבר על המגבלות הקשורות ביולומינסנציה הקלטה. הדו ח הנוכחי מתאר מערכת מבוססת פלורסצנטיות, אשר נבנה כדי לנטר את שעון היממה של ה SCN ויוו במעבר בחופשיות עכברים. שיטה זו קלה לשימוש מאפשר ניטור רציף במהלך המחזור/כהה ומאפשר התבוננות שעתוק של גנים שעון היממה SCN בזמן אמת, ברזולוציה הטמפורלית גבוהה לטווח ארוך.
Protocol
Representative Results
Discussion
לעומת שיטות שמחוץ , כגון פרוסה תרבות4,5, RT-PCR16 בחיי עיר הכלאה17, אשר דורשים כי חיות להרוג, ויוו הקלטה בשיטה מאפשר החוקרים ללמוד על ביטוי גנים היממה בחיים. ככזה, טכנולוגיה זו מספקת את היכולת להעריך את השפעת לפליטת פיזיים ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי במעבדה ג’אנג למתן גירוי חברים במעבדה Zhan ודיונים על מתן סיוע טכני. מחקר זה נתמך על ידי מענקים 31500860 (כדי C.Z.) של NSFC, 2012CB837700 (ל E.E.Z. ו- C.Z.) של התוכנית 973 מ M.O.S.T. של סין, על ידי מימון מהממשלה העירוני של בייג’ינג. E.E.Z. נתמך על ידי הסינים “גיוס תוכנית גלובלית הנוער המומחים”.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
