यह नव विकसित प्रतिदीप्ति आधारित प्रौद्योगिकी के suprachiasmatic नाभिक में circadian घड़ी जीन की प्रतिलेखन की लंबी अवधि की निगरानी सक्षम बनाता है (SCN) आज़ादी से वास्तविक समय में चूहों चलती है और एक उच्च लौकिक संकल्प पर ।
इस तकनीक ऑप्टिकल फाइबर मध्यस्थता प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग रिकॉमबिनेंट adeno-जुड़े वायरस आधारित जीन पत्रकारों के सटीक वितरण के साथ जोड़ती है. इस नए और आसान vivo प्रतिदीप्ति मॉनिटरिंग सिस्टम में उपयोग करने के लिए घड़ी जीन के transcriptional ताल रिकॉर्ड विकसित किया गया था, Cry1, स्वतंत्र रूप से चलती चूहों के suprachiasmatic नाभिक (SCN) में. ऐसा करने के लिए, एक Cry1 प्रतिलेखन प्रतिदीप्ति रिपोर्टर डिजाइन और Adeno में पैक-जुड़े वायरस था । शुद्ध, केंद्रित वायरस माउस SCN में इंजेक्शन एक ऑप्टिक फाइबर, जो तब मस्तिष्क की सतह पर तय किया गया था की प्रविष्टि के बाद किया गया था । जानवरों को अपने घर पिंजरों को लौट रहे थे और एक 1 महीने के बाद ऑपरेटिव वसूली अवधि के लिए पर्याप्त रिपोर्टर अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने की अनुमति दी । प्रतिदीप्ति तो आज़ादी से चलती चूहों में एक के माध्यम से दर्ज किया गया था vivo निगरानी प्रणाली है कि हमारे संस्थान में निर्माण किया गया था । vivo रिकॉर्डिंग सिस्टम में , एक ४८८ एनएम लेजर के लिए एक 1 × 4 बीम के साथ युग्मित-अलगानेवाला कि समान शक्ति के चार लेजर उत्तेजना outputs में प्रकाश विभाजित किया गया था । इस सेटअप हमें एक साथ चार जानवरों से रिकॉर्ड करने के लिए सक्षम होना चाहिए । उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेतों में से प्रत्येक एक photomultiplier ट्यूब और एक डेटा अधिग्रहण कार्ड के माध्यम से एकत्र किया गया था । vivo circadian घड़ी रिकॉर्डिंग तकनीक में पिछले bioluminescence के विपरीत, vivo रिकॉर्डिंग सिस्टम में इस प्रतिदीप्ति प्रकाश चक्र के दौरान circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति की रिकॉर्डिंग की अनुमति दी ।
स्तनधारी में, suprachiasmatic नाभिक (SCN) पूरे शरीर की circadian लय को नियंत्रित करने के लिए एक व्यक्ति की प्रतिक्रिया exogenous पर्यावरण परिवर्तन (जैसे, प्रकाश, तापमान, तनाव, आदि)1समंवय । कोर घड़ी घटकों Per1-3, Cry1-2, घड़ी, और Bmal1से मिलकर बनता है, और प्रत्येक कोशिका के circadian घड़ी को विनियमित करने में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । SCN में प्रत्येक कोशिका transcriptional उत्प्रेरक, घड़ी/BMAL1, जो प्रति और रोने की अभिव्यक्ति पैदा करने के लिए एक heterodimer के रूप में कार्य करता है शामिल हैं । प्रति/रोना परिसर तो घड़ी/BMAL1 के समारोह के लिए एक प्रतिलेखन-अनुवाद राय पाश है कि के बारे में 24 h2,3पूरा करने के लिए लेता फार्म को रोकता है ।
SCN पर पिछले अध्ययन मुख्य रूप से पूर्व vivo SCN स्लाइस संस्कृति विधि4,5,6 कार्यरत है और, जबकि इस दृष्टिकोण मूल्यवान जानकारी प्रदान की गई है, अपनी सीमाओं को हमारे करने की क्षमता को बाधित किया है SCN पर अन्य मस्तिष्क नाभिक के प्रभाव के बारे में डेटा प्राप्त करें, साथ ही इस महत्वपूर्ण क्षेत्र में रहने वाले कोशिकाओं पर exogenous उत्तेजनाओं (जैसे, प्रकाश) के प्रभाव के रूप में. २००१ में, हितोशी है Okamura समूह सबसे पहले bioluminescence प्रणाली में vivo मॉनिटर circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति में SCN में स्वतंत्र रूप से चूहों7ले जाने के लिए उपयोग किया गया था । केन-इची है Honma समूह पिछले कुछ वर्षों बिताया है आगे SCN8,9,10में vivo रिकॉर्डिंग प्रणाली में bioluminescence के विकास । साथ में, इन अध्ययनों ने शोधकर्ताओं को लगातार अंधेरे में या हल्की नाड़ी के बाद circadian घड़ी की निगरानी करने की क्षमता प्रदान की है । हालांकि, क्योंकि bioluminescence भी प्रकाश/अंधेरे चक्र के दौरान सतत निगरानी के लिए अनुमति देने के लिए मंद है, तथ्य यह है कि प्रकाश प्रमुख SCN-circadian घड़ियों11की मध्यस्थता entrainment के लिए आवश्यक संकेत है के साथ युग्मित, वहां है प्रयोगात्मक तरीकों के विकास के लिए बढ़ती मांग है जो bioluminescence रिकॉर्डिंग के साथ जुड़े सीमाओं को दूर । वर्तमान रिपोर्ट में एक प्रतिदीप्ति-आधारित प्रणाली का वर्णन है जिसका निर्माण SCN की circadian घड़ी में vivo में स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में निगरानी के लिए किया गया था. यह आसान करने के लिए उपयोग विधि प्रकाश/अंधेरे चक्र के दौरान सतत निगरानी परमिट और वास्तविक समय में और उच्च लौकिक संकल्प में SCN में circadian घड़ी जीन की प्रतिलिपि की लंबी अवधि के अवलोकन के लिए अनुमति देता है ।
इस तरह के स्लाइस संस्कृति4,5, आर टी-पीसीआर16, और सीटू संकरण17 में , जो कि जानवरों को मार डाला जा की आवश्यकता के रूप में पूर्व vivo तरीकों, के विपरीत, vivo रिकॉर्डिंग वि?…
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए उत्तेजक चर्चाएं और Zhan लैब में सदस्यों को उपलब्ध कराने के लिए झांग लैब में सदस्यों को धंयवाद । इस शोध का समर्थन किया गया था अनुदान ३१५००८६० (C.Z.) के NSFC, 2012CB837700 (करने के लिए E.E.Z. और C.Z.) चीन के M.O.S.T. से ९७३ कार्यक्रम के, और बीजिंग नगर निगम सरकार से धन द्वारा । E.E.Z. चीनी “वैश्विक युवा विशेषज्ञों की भर्ती कार्यक्रम” द्वारा समर्थित किया गया था ।
KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |