生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング
Summary
この新しく開発された蛍光ベースの技術は、リアルタイムで、高時間分解能でマウスを自由に移動を視交叉上核 (SCN) における概日時計遺伝子の転写の長期監視できます。
Abstract
この手法では、遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子レポーターの正確な配信を介した光ファイバー蛍光録音を組み合わせたものです。自由行動マウスの視交叉上核 (SCN) のCry1、時計遺伝子の転写リズムを記録するこの新しい使いやすい体内蛍光監視システムが開発されました。これを行うには、 Cry1転写蛍光レポーターはように設計されアデノ随伴ウイルスにパッケージ化します。精製、濃縮されたウイルスは、マウスの脳の表面に固定し、光ファイバーの挿入に続いて SCN に注入されました。動物は彼らの家のケージに返され、記者表現を確保するため 1 月手術後の回復期間を許可しました。蛍光生体内で私たちの機関で構築されたシステムの監視を介してマウスを自由に移動で、記録されました。生体内で記録システム、488 nm のレーザー光を分割と同等の力の 4 つのレーザー励起出力 1 × 4 のビーム ・ スプリッターと結合されていました。このセットアップでは、同時に 4 匹の動物から記録することができました。放出される蛍光信号の各は、光電子増倍管とデータ集録カード経由で集められました。対照的に概日時計記録技術体内前生物発光にこの蛍光体内の記録システムにライト サイクルにおける概日時計遺伝子の発現の録音を許可します。
Introduction
哺乳類の視交叉上核 (SCN) は外因性の環境の変化(例えば光、温度、圧力等)1の個々 の応答を調整するための全身の概日リズムを支配します。時計のコア コンポーネントは、 Per1 3 Cry1 2、クロック、およびBmal1から成り、各セルの体内時計の調節に中心的な役割を果たします。SCN の各セルに転写活性化因子、時計/BMAL1 は、あたりの発現を誘導するヘテロダイマーとして機能が含まれていますと泣く。1 件/泣くコンプレックスは、時計/BMAL1 約 24 時間は、完全な2,3転写翻訳フィード バック ループを形成するための機能を阻害します。
SCN に関する先行研究は主に前のヴィヴォSCN スライス培養法4,5,6を採用しているし、このアプローチは、貴重な情報を提供して、一方その限界抑制する当社の能力この重要な地域に存在する細胞に及ぼす外因性刺激 (例えば、光) と同様に、SCN に他の脳の核の影響に関するデータを取得します。2001 年岡村仁グループ自由行動マウス7SCN のモニター時計遺伝子体内に発光システムを使用する第 1 だった。本間健一のグループは、生物発光、生体内でSCN8,9,10の記録システム開発さらに過去数年間を費やしてきた。一緒に、これらの研究は、暗黒や光パルスの後、概日時計を監視する能力を持つ研究者を提供しています。ただし、発光は光が体内時計11SCN を介した同調に必要な支配的な信号であるという事実と相まってダーク/ライト サイクル中に継続的な監視を可能にするのには暗すぎるためには生物発光の記録に関連付けられている制限を克服する実験法の開発のための需要が増加しています。現在のレポートでは、SCN は、生体内で自由行動マウスの体内時計を監視するため建設された蛍光ベースのシステムについて説明します。この簡単に使用できるメソッドは明暗サイクル中に継続的な監視が可能でき、高時間分解能のリアルタイムでの SCN における概日時計遺伝子の転写の長期観察のため。
Protocol
Representative Results
Discussion
前のヴィヴォメソッドでは、スライス文化4、5RT-PCR 法16の in situハイブリダイゼーション17動物が殺されることを必要とするなどとは対照的体内法を記録できます。生きている動物の概日遺伝子発現を研究する研究者。そのため、この技術は、ニューラル サーカディアン ・ クロックについて?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはテクニカル サポートを提供する刺激的な議論と占研究室のメンバーを提供するため張研究室のメンバーに感謝します。この研究は、NSFC は、中国の M.O.S.T. から 973 プログラムの (E.E.Z. および C.Z.) に 2012CB837700 の補助金 (C.Z.) に 31500860 によって、北京市政府から資金援助によってサポートされていました。E.E.Z. は、中国「の募集プログラムのグローバル青年専門家」によって支えられました。
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
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