生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム
Summary
ここでは、解明in vitroとin vivoの分化のフィーダー フリー システムを使用して、マウスの NK 細胞の遺伝子サイレンシングを量産するためのプロトコルを提案する.
Abstract
ナチュラル キラー (NK) 細胞は自然免疫系に属する、ファーストラインの抗がん免疫の防衛;腫瘍微小環境における抑制し、基になるメカニズムはまだあまり知られていません。NK 細胞の一貫性と信頼性の高いソースの欠如は、NK 細胞免疫の研究の進捗状況を制限します。フィーダー無料条件下でマウスの NK 細胞の骨髄由来の高い質と量を提供できる生体外でシステムを報告する.もっと重要なことは、また、このシステムを使用して正常に E4bp4 依存性 NK 細胞の成熟を阻害 siRNA による遺伝子サイレンシングを示します。したがって、この新規培養NK 細胞システムの差別化は、免疫研究のための生体材料ソリューションです。
Introduction
癌の進行、腫瘍微小環境1、2、宿主由来の免疫細胞、例えば、NK 細胞などに大きく依存します。いくつかの研究は、腫瘍内 NK 細胞は腫瘍進行3,4と負の相関を示した。さらに、臨床研究は、NK 細胞養子療法ががん5,6,7,8,9のための可能な戦略であることを示した。NK 細胞を用いたがん免疫療法は最近固形腫瘍に対する治療の選択肢として提案したが、免疫サイトカインの分泌と固形腫瘍の微小環境における配位子のアクティブ化のための課題が存在10,11。変換増殖因子 β (TGF-β) 細胞がん化の抑制の役割を果たすことが示唆されているが逆説的に癌細胞はまた腫瘍開発12,13,14をサポートする TGF-β 1 を生成,15. インターフェロン応答性の制御を介した CD16 インターフェロン γ (IFN-γ) 生産の in vitro16,17、NK 細胞の細胞障害活性を抑制することができます TGF-β シグナル 18。
腫瘍微小環境における TGF-β シグナルの混乱は、がんを除去するための可能な方法もありますが、完全に TGF-β シグナルをブロックになります、その抗炎症機能による自己免疫疾患の開発によって証明されるよう副作用全身性炎症を含む、心血管の欠陥や自己免疫マウスで19をモデル化します。したがって、TGF β を介した免疫抑制の動作メカニズムを理解することは、ガン治療のためのアクセス可能な治療上のターゲットの同定に します。
NK 細胞の発達に必要な分子のイベントを明らかにするには、ウィリアムズらは20NK へ骨髄造血幹細胞と分化細胞の培養システムを確立しました。このシステム主として NK 細胞、NK 細胞21の新規前駆体の同定を含む機構の解明が容易になります。しかし、骨髄前駆細胞はフィーダー層20,21, OP9 細胞をサポート システムで培養する必要があります、この異種細胞集団は主遺伝子撹乱のそれ以上の適用を制限ツール(例えば、siRNA による遺伝子サイレンシング) NK 細胞に特に適用されます。
ここでは、さらにウィリアムズら20の生体外でシステムを変更することによって開発されている無料の送り装置システムについて述べる。我々 のシステムで OP9 管間質フィーダー細胞に必須ではありません、OP9 条件付きのメディアが最近 NK 細胞培養、およびこれの分化に影響を与えずに使用を導く TGF-β は経由で癌の進行を促進することを明らかにする代わりに腫瘍微小環境22E4bp4 依存性 NK 細胞の発達を抑制します。この新しいシステムは、正常に特定条件下で NK 細胞の分化の分子機構を解明するため背景無料メソッドを提供します (例えば、高い TGF-β 1、siRNA による遺伝子サイレンシングなど)。生体外で。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では骨髄由来マウス NK 細胞の培養を生産するための手法を説明しました。オリジナル システム21,22細胞フィーダーは正常に OP9 細胞分化システムの安定性を大幅に増加したの条件の中に置き換えられます。さらに、システムは高い量を作り出すことができる、成熟 NK の純度培養し、体内の細胞の試金は、NK 細胞による疾?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は研究-香港中文大学 (2016.035) と香港の学者の研究助成評議会の香港 (GRF 468513、12 r CUHK3/CRF) と革新と技術香港ファンド (ITS InP/164/16、ITS/227/15 ITS-InP/242/16)、直接助成金によって支えられました。プログラム。
H. Y.L. 設計しすべての実験を監督し、原稿の準備に貢献しました。午後-高橋啓介実験データを分析、原稿の準備に貢献しました。P. C. T.J.Y. ・ FC、t. j. s. c.、h.、Q.-m. w.、G. Y.L. 動物試料を収集し、動物実験に参加したと。X.-相対湿度、j. s. k. エフティが原稿を準備するに貢献したと。
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
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