一种新型大鼠自然杀伤细胞无饲养系统的研究体外
Summary
在这里, 我们提出了一个 mass-produce 基因沉默小鼠 NK 细胞的协议, 使用无馈线分化系统的机械研究体外和在体内。
Abstract
自然杀手 (NK) 细胞属于先天免疫系统, 是一线抗癌免疫防御;然而, 它们在肿瘤微环境中被压制, 其基本机制仍然是未知的。nk 细胞缺乏一致、可靠的来源, 限制了 nk 细胞免疫的研究进展。在这里, 我们报告一个体外系统, 可以提供高质量和数量的骨髓来源的小鼠 NK 细胞在无饲养条件下。更重要的是, 我们还证明, siRNA 介导的基因沉默成功地抑制了 E4bp4-dependent NK 细胞成熟, 利用该系统。因此, 这本新的体外NK 细胞分化系统是一种生物材料免疫研究的解决方案。
Introduction
癌症进展主要依赖于肿瘤微环境1,2, 包括主机派生的免疫,, NK 细胞。几项研究表明, 肿瘤的 NK 细胞呈负相关的癌症进展3,4。此外, 临床研究表明 NK 细胞过继疗法是一种可能的治疗癌症的策略5,6,7,8,9。NK 细胞癌免疫治疗是最近被认为是一种治疗选择的固体肿瘤, 但存在的挑战, 由于免疫抑制剂的分泌因子和下调激活配体在微环境中的实体肿瘤10,11。转化生长因子β (TGF β) 已被认为起抑制作用的致癌作用, 但矛盾的癌细胞也产生 TGF-β1支持肿瘤的发展12,13,14,15. TGF β信号通过下调干扰素反应性和 CD16-mediated 干扰素-γ-γ (干扰素) 产生抑制 NK 细胞的细胞活性体外16,17, 18。
虽然 TGF β信号在肿瘤微环境中的破坏可能是消除癌症的一种可能的方法, 完全阻断 TGF β信号将导致自身免疫性疾病, 由于其抗炎作用, 证明了发展不良副作用包括全身炎症、心血管缺陷和自身免疫在小鼠模型中的19。因此, 了解 TGF β介导的免疫抑制的工作机制将导致确定一个治疗癌症的辅助性治疗靶。
为了阐明 nk 细胞发育所需的分子事件, 威廉斯et al.建立了一个用于将小鼠骨髓造血干细胞分化为 nk 细胞的体外系统20。该系统在很大程度上促进了 nk 细胞发育的机制研究, 包括对 nk 细胞的新祖的鉴定21。然而, 骨髓祖细胞应在系统中培养, 以支持 OP9 基质干细胞为饲养层20,21, 而这种异构的细胞群在很大程度上限制了基因中断工具的进一步应用(例如, siRNA 介导的基因沉默) 专门用于区分 NK 细胞。
在这里, 我们描述一个无馈线系统, 已经开发的进一步修改的在体外系统的威廉姆斯et al20。在我们的系统中, 不需要 OP9 基质饲养细胞, 而使用 OP9 条件培养基, 而不影响 NK 细胞的分化在体外, 这最近导致我们发现, TGF β能够促进癌症进展通过抑制 E4bp4-dependent NK 细胞在肿瘤微环境中的发育22。该系统成功地提供了一种无背景的方法来阐明在特定条件下 NK 细胞发育的分子机制 (例如, 高 TGF β, siRNA 介导的基因沉默, etc。体外。
Protocol
Representative Results
Discussion
在目前的工作中, 我们描述了一种新的方法生产骨髓源性小鼠 NK 细胞体外。原始系统21、22中的单元格进纸器被 OP9 单元的条件介质成功替换, 这极大地提高了微分系统的稳定性。此外, 该系统还能为体外的成熟 nk 细胞产生高纯度的增殖和纯化, 并能促进人体疾病中 nk 细胞的机械研究和转化研究.
所描述的方法已?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到香港研究资助局 (GRF 468513、CUHK3/CRF/12R) 及香港创新科技基金 (ITS/227/15、其 InP/164/16、ITS-InP/242/16)、中大 (2016.035) 及香港学者的直接资助。程序.
/设计和监督所有的实验, 并为手稿的编写做出贡献。康普茶进行了实验, 分析了数据并为稿件的编写做出了贡献。t。彼莱, 俱乐部, M.W., 和 G.-/收集动物标本, 并参与动物实验。右侧和 K-f.t 为手稿的编写做出了贡献。
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
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