Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке
Summary
Здесь мы представляем протокол в массовое производство сайленсинга генов мышиных НК-клеток с помощью свободной подачи дифференциации системы для механистический исследование в пробирке и в естественных условиях.
Abstract
Природные убийца (НК) клетки принадлежат к врожденной иммунной системы и первой линии борьбы против рака иммунной защиты; Однако они подавляются в микроокружения опухоли и основной механизм по-прежнему во многом неизвестным. Отсутствие последовательной и надежным источником НК-клеток ограничивает ход исследований NK клеток иммунитета. Здесь мы приводим в vitro систему, которая может обеспечить высокое качество и количество костного мозга-производные мышиных NK клеток при условии подачи бесплатно. Что еще более важно мы также продемонстрировать, что малых интерферирующих РНК опосредованной генов успешно тормозит созревание клеток NK E4bp4-зависимых с помощью этой системы. Таким образом этот роман в vitro NK клеток дифференциации системы это решение биоматериала для исследования иммунитета.
Introduction
Прогрессии рака в значительной степени зависит от опухоли микроокружения1,2, включая хост производные immunocytes, например, НК-клеток. Несколько исследований показали, что клетки внутриопухолевых негативно коррелируется с3,прогрессии опухоли4. Кроме того клинические исследования показали, что НК клеточной терапии приемных возможная стратегия для рака5,6,,78,9. NK на основе ячеек Рак иммунотерапия недавно была предложена в качестве терапевтического вариант для солидных опухолей, но существуют проблемы из-за секрецию цитокинов иммуносупрессивных и Даунрегуляция активации лигандами в микроокружения твердых опухолей 10,11. Преобразование фактор роста β (TGF-β) было предложено играть подавляющих роль в канцерогенеза, но парадоксально раковые клетки также производят TGF-β1 поддержать опухоли развития12,13,14 , 15. Фонд TGF-β сигнализации можно подавить цитолитических активности НК-клеток через вниз регулирует отзывчивость интерферона и CD16-опосредованной интерферона гамма (ИФН γ) производство в vitro16,17, 18.
Хотя нарушение TGF-β сигнализации в микроокружения опухоли может быть одним из возможных путей для устранения рака, полностью блокируя TGF-β сигнализации вызовет аутоиммунных заболеваний из-за его противовоспалительные функции, о чем свидетельствует разработка 19модели неблагоприятные побочные эффекты, включая внутрирастительного воспаления, сердечно-сосудистых дефектов и аутоиммунные заболевания в мыши. Таким образом понимание механизма работы TGF-β-опосредованной иммуносупрессия приведет к идентификации доступных терапевтических мишенью для лечения рака.
Для выяснения молекулярные события, необходимые для развития клеток NK, Williams et al. создал систему в пробирке для дифференциации мышиных костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток в NK клеток20. Эта система во многом облегчает механистический исследование развития НК клеток, включая выявление Роман прародителями NK клеток21. Однако, предшественники костного мозга следует культивировали в системе с поддержкой OP9 стромальные клетки как фидер слоя20,21, и этой неоднородной ячейки населения во многом ограничивает дальнейшее применение гена-срыве инструменты (например, малых интерферирующих РНК опосредованной генов) конкретно применительно к дифференциации НК-клеток.
Здесь мы описываем фидер бесплатная система, которая была разработана путем дальнейшего изменения системы в vitro Williams et al20. В нашей системе OP9 клетки стромы фидер не требуются, и вместо OP9, условно средних используется не затрагивая дифференциации NK клеток в пробиркеи это недавно привести нас к раскрыть, что способны содействовать прогрессии рака через TGF-β подавление развития НК E4bp4-зависимых клеток в микроокружения опухоли22. Эта новая система успешно обеспечивает фон, свободной метод для выяснения молекулярный механизм развития НК клеток при определенных условиях (например, высокая TGF-β1, сайленсинга генов малых интерферирующих РНК опосредованной, и т.д.) в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящей работе мы описали новый метод для производства костного мозга-производные мышиных NK-клетки в пробирке. Клетки фидера в оригинальной системы21,22 успешно заменены условной средней OP9 клеток, которые во многом увеличена стабильность систем?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано исследовательских грантов Совета Гонконга (ГФП 468513, CUHK3/ОФД/12R) и инноваций и технологий фонд Гонконга (СТС/227/15, ее ИЯФ/164/16, СТС-ИЯФ/242/16), прямые субсидии для исследования-CUHK (2016.035) и Гонконг ученый Программы.
H.-ю.л. разработан и под наблюдением все эксперименты и внесли вклад в подготовку рукописи. Ч-к.т. эксперименты, анализ данных и внесли вклад в подготовку рукописи. P.C.-Т. Т., Д.Ю-Ф.К, и.с.-C., H., Q.-М.В, и G.-ю.л. животных пробы и участвовал в подопытных животных. И.с., X.-правый, и K.-чл.КОРР способствовала подготовке рукописи.
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
