熱帯熱マラリア原虫減衰全反射赤外分光法と多変量データ解析による水溶液赤い血球での検出と定量
Summary
ここでは、検出及び減衰全反射赤外分光光度計と多変量解析を使用して感染した水溶液赤い血液細胞で熱帯熱マラリア原虫の定量化のプロトコルを提案する.
Abstract
多変量データ解析 (と共に簡単な卓上型減衰全反射フーリエ変換赤外 (ATR FTIR) 分光計を使用して定量法と水溶液中の赤い血球 (赤血球) の寄生虫の検出を示すMVDA)。3 7マラリア10% 寄生リング ステージ寄生虫に培養、希釈に 0-1 の間にシリーズを作成する分離された新鮮なドナーの赤血球をスパイクに使用 %。10 μ L 各サンプルのスペクトルを取得する ATR ダイヤモンド ウィンドウの中央に置かれました。信号対雑音比を改善するために、水の寄与を削除するサンプル データが扱われ、二次導関数はスペクトルの特徴を解決に適用されます。データは、MVDA の 2 種類を使用して行った: 最初主成分分析 (PCA) とを決定する任意の飛び地、偏最小 2乗回帰 (PLS-R) 計量化モデルを構築します。
Introduction
マラリアは私達の時間の最も破壊的な病気の中で、します。半分以上の人口の流行地における生活し、貧しい1,2,3,4の過度に負担。問題の大部分は無症候性キャリアと初期段階患者蚊ベクトル5のための貯蔵所として機能するぬれた季節の間に感染症のスパイクを引き起こすとのコミュニティを保持することができます。マラリアは、最も致命的なうちはマラリア病2の最も深刻な形を引き起こす 5 つの原虫が原因です。
現在、マラリアの診断技術は完璧未満です。光学顕微鏡法の現在のゴールド スタンダードのみ 62 88 寄生虫/μ L 使用方法6によってを検出できます。集約と高スキルが必要、多くの地域の顕微鏡検査の誤診のためさらに、> 50% 例, 低 parasitaemia との特にそれらレベル2地域で資源との結果の欠如に直接帰することができます。抗マラリア薬の誤用。主な診断の他の 2 つの方法は、検出、およびポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) アッセイの識別し、DNA から寄生虫を定量化するための抗体を利用した迅速診断テスト (RDTs) です。現在、RDTs は放置されている疾患のより稀な形態の結果として血の少なくとも 100 の寄生虫/μ L のp. の vivax マラリアを検出することができるのみ。7,8対照的に、PCR の試金の識別し、定量化 0.0004 5 の感度でマラリア原虫の異なる種の血液の寄生虫/μ L。しかし、それは高価な試薬、機器、技術的なスキルを必要としては現場への適用のために適していなかった。
機密性の高い、信頼性と手頃な価格の技術は診断時間従って患者の転帰の改善と病気の除去を可能を改善するために不可欠です。減衰全反射フーリエ変換 (ATR FTIR) 分光法では、この問題の潜在的なソリューションを提供しています。前作は検出し、メタノールの検出限界を達成する血膜を固定でマラリアを定量化することが可能だったことを示している < 1 寄生虫/μ L の血液 (< 0.0002% 寄生)9PCR 法と対等であります。最近の研究では、検出および水溶液試料中の寄生虫を定量化し、従って固定ステップを排除することが可能であるを示しています。ただし、水蒸気、スペクトルのノイズやデータ処理などの要因は、最適な結果10の考慮する必要があります。
このプロトコルは、ATR FTIR スペクトルを取得および水溶液赤い血球 (RBC) サンプル10からマラリアの検出のための回帰モデルを準備する方法を示しています新しいユーザーを目指しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
PLS モデルは線形関係、Y チャイルド多変量法 = bX + E、予測変数 X の (ここでは、各波数で吸光度) および連続変数 Y (ここで寄生率レベル)。一言で言えば、モデル x の X が Y と相関の差異をキャプチャ潜在変数 (LVs) の新しいセットを作成する変数を結合し、回帰ベクトル (b) を計算する y 値の推定における新しいスペクトルの結果を乗算します。2 つの値からモデルの強さを取ることができる: …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
オーストラリアの研究議会によって著者に資金提供された (BRW に将来交わり FT120100926)、国立保健医療研究評議会オーストラリアの (プログラム助成金と国債; する上級研究員奨学金のキャリア初期 JSR;研究のインフラ機関バーネット研究所サポート方式の補助金)、ビクトリア州政府の運用インフラストラクチャ サポートのバーネット研究所に許可と。我々 は手段的扶養氏フィンレー シャンクスを認めます。
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
