Imagem latente funcional das fábricas de transcrição Viral usando microscopia de fluorescência 3D
Summary
Fábricas de transcriptional virais são estruturas discretas que são enriquecidas com celular RNA polimerase II para aumentar a transcrição do gene viral durante a reativação. Aqui, um método para localizar sites de ativamente transcrevendo cromatina viral em 3D espaço nuclear por uma combinação de hibridação de RNA de coloração e em situ de imunofluorescência é descrito.
Abstract
É sabido que o Regulamento espacial e temporal de genes é parte integrante que regulam a expressão genética adequada. Consequentemente, é inestimável para entender onde e quando a transcrição está ocorrendo dentro espaço nuclear e para visualizar a relação entre episomes infectado dentro do núcleo da célula da mesma. Aqui, tanto de imunofluorescência (IFA) e RNA-peixe tem sido usadopara identificar ativamente transcrevendo episomes herpesvirus associado sarcoma de Kaposi (KSHV). Manchando o antígeno nuclear KSHV associada a latência (LANA), é possível localizar onde episomes virais existem dentro do núcleo. Além disso, através da concepção de sondas de RNA-peixe para atingir a região intrão de um gene viral, que é expressa somente durante a infecção produtiva, transcritos de RNA nascentes podem ser localizados. Usando esta combinação de sondas moleculares, é possível visualizar a montagem de fábricas grandes transcrição viral e analisar o Regulamento espacial da expressão do gene viral durante a reativação KSHV. Incluindo a mancha do anticorpo anti-RNA polimerase II, se pode visualizar também a associação entre a agregação de RNA polimerase II (RNAPII) e transcrição de KSHV durante a reativação.
Introduction
Tornou-se cada vez mais claro que a organização spatiotemporal do núcleo desempenha um papel importante em modular a expressão gênica afinada em eucariontes. A maioria dos genes específicos do tecido estão distribuídos em muitos cromossomos e precisam ser regulada de forma síncrona a fim de responder a estímulos específicos em uma maneira coordenada1. Células constroem cubos cromatina ativa (ACH), como uma forma de reunir os genes e seus componentes cis-regulatórios para um espaço nuclear específico1.
Também foi demonstrado por vários estudos que embora o núcleo parece muito denso e viscoso, moléculas biologicamente ativas podem atravessar o núcleo rapidamente através de de difusão2. Como consequência dessa propriedade efêmera, a maioria das proteínas de ligação de DNA ‘salto’ de ligação local para ligação local, sentindo o seu caminho em torno do espaço nuclear, que permite a um núcleo altamente adaptável e versátil2.
Apesar deste comportamento dinâmico de biomoléculas dentro do núcleo, nuclear corpos sem membranas tais como (mas não se limitando a) o nucléolo, corpos de Cajal e corpos nucleares do leucemia promielocítica (PML-NB) ainda existem. É através de uma variedade de mecanismos, tais como repetições de DNA em tandem (nucléolo), rRNA (nucléolo) e proteínas estruturais como coilina (corpos de Cajal) ou PML proteínas (PML-NB) que mantêm essas construções juntos3,4,5 . Estas estruturas e outras congregações como fábricas de transcrição servem como andaimes que não apenas aumentam a concentração local de componentes necessários, mas também regulam a composição de proteínas e ácidos nucleicos dentro deles para, finalmente, criar um site central para funções celulares eficiente6.
Visualizar onde e quando forma estruturas nucleares oferece uma riqueza de informação para pesquisadores estudando epigenética. De uma perspectiva de virologia, a reativação do vírus Latentemente infectadas, tais como KSHV, altera significativamente a paisagem do núcleo e distribuição das enzimas nucleares para shift transcrição principalmente a partir de genes celulares para genes virais, em última análise, para produzir progênie viral totalmente funcional7,8. Como KSHV manipular a maquinaria de expressão do gene celular para facilitar a expressão dos genes virais? Essas informações também poderiam lançar luz sobre mecanismos de regulação do gene celular temporal.
Como todos os outros herpesviruses, KSHV tem dois ciclos de vida chamados latência e replicação lítica. KSHV reside principalmente na fase de latência, em que a maioria de seu gene viral, expressão é silenciado, exceto latência associado genes9,10. Durante a latência que KSHV produz latência associado antígeno nuclear (LANA), que constitutivamente vincula os genomas virais e amarras viral da cromatina do cromossomo humano11. Por causa do relacionamento íntimo da LANA com o genoma viral, é possível usar o IFA e DAPI para manchar e localizar onde os episomes virais foram em relação a cromatina de anfitrião.
Para estudar a reativação de KSHV no nível do episome único e a associação com outros episomes virais em uma célula infectada, foi estabelecida uma estratégia para localizar ativamente transcrevendo cromatina viral em situ . Por conseguinte, LANA e RNAPII IFA com intrão RNA-peixe foram combinadas, através da geração de sondas de RNA-peixe que se ligam à região intrão (sonda exata sequências podem ser encontradas em de publicação mais recente do laboratório Izumiya8) de KSHV K-Rta-a proteína viral-chave que é essenciais e suficientes para KSHV reativação foi possível identificar onde a transcrição na verdade estava tomando lugar8,11,12,13,14,15 . Este intrão técnica RNA-peixe permite que pesquisadores de Visualizar onde mRNA ser transcrito imediatamente antes de ser emendado e exportado para o citoplasma16,17.
KSHV pode ser reativado por vários estímulos químicos incluindo phorbol ésteres como 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) e inibidores de histona deacetilase como butirato de sódio, adicionalmente KSHV podem ser induzidos a reativar pela superexpressão de o fator de transcrição viral, K-Rta19. Pesquisadores com sucesso aumentaram a eficiência de reativação KSHV sincronizando ciclos da célula antes de induzir a reativação18. Assim, para estes estudos especiais, as células foram sincronizadas usando um bloco de timidina duplo (protocolo descrito abaixo) e incubadas com TPA e doxiciclina (Dox) durante um curto período de tempo. Doxicilina foi usada porque a linha de celular utilizada nestas experiências tem uma gaveta de doxiciclina-inducible K-Rta, que foi clonada do cDNA e não inclui a região de intron do K-Rta. Embora seja possível reativar KSHV usando apenas induzida expressão K-Rta, está comprovado por outros pesquisadores que, devido a uma variedade de diferentes fatores bioquímicos só expressão de K-Rta revela-se uma reativação fracos estímulos20. Através da combinação de todos estes e limitando-se a incubação do droga para um curto período de tempo, uma reativação de KSHV robusta mas não excessivamente artificial foi alcançada para a imagem latente.
Depois da rotulagem LANA, RNAPII, intrões K-Rta e DNA como descreveram neste artigo, imagem de fluorescência 3D foi realizada utilizando um microscópio de deconvolução widefield. Após o processamento com software de imagem, a distribuição espacial de episomes virais ativos pode ser avaliada corretamente. Usando esta técnica, as questões centrais sobre a natureza fundamental da formação da cromatina ativo hubs e outras estruturas nucleares podem ser estudadas. Ter episomes virais idênticos em uma única célula que processa os mesmos elementos normativos pode representar uma ferramenta de pesquisa exclusivo para aprofundar a compreensão dos mecanismos de regulação do gene spatiotemporal.
Uma limitação em termos de imagens várias espécimes de célula fixadas em pontos de tempo diferentes para caracterizar um processo inerentemente dinâmico molecular é que mudanças sutis ou em pequena escala na distribuição de fluorescência são detectadas ou considerado insignificantes. Isto é verdadeiro, a não ser no caso raro, cada célula observada exibe a mesma mudança sutil. Assim, a relação completa spatiotemporal de transcrição viral ativa e outras estruturas nucleares não pode ser criticamente avaliada utilizando imagens fixas. Para solucionar esses desafios técnicos, a melhor abordagem é a imagem ao vivo de células que têm marcado a episomes virais e a seguir a localização das principais enzimas celulares ao longo do tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem alguns aspectos do protocolo que pode ser alterada para acomodar circunstâncias incomuns. A escolha de fixação e permeabilização de buffers também pode ser alterada. Para os buffers de fixação, paraformaldeído também é eficaz e etanol pode ser usado para permeabilização.
Extingue o formaldeído com glicina que PBS é recomendado pois impede o formaldeído desabilitando os anticorpos na ausência de albumina de soro bovino (BSA), mas se as lamelas são lavadas completamente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela concessão do National Institutes of Health (R01-DE025985) e por um americano câncer sociedade Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Este trabalho também foi apoiado por subsídios do departamento de agricultura dos EUA (2015-67015-23268 e 2014-67015-21787) e nova bolsa de iniciativa de investigação da Universidade da Califórnia, Davis.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
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